Ανάπτυξη λιποσωμικών μορφών ρελαξίνης-2 και παραγώγων αυτής, για παράταση της διάρκειας δράσης τους

Abstract

Nanotechnology in pharmacy is a broad scientific field that has emerged from the convergence of disciplines such as health and pharmaceutical sciences, molecular chemistry, and engineering. It has contributed significantly to the enhancement of the stability of therapeutic agents and their targeted delivery to diseased tissues. Several types of nanoparticles have been proposed for the encapsulation of active substances. At the same time, studies have been conducted on the modification of active molecules with the aim of prolonging their pharmacological action by optimizing their stability in the circulatory system. In the present dissertation, Relaxin-2 (RLX2), a multifunctional hormone of the insulin-like peptide family, was investigated. This peptide exerts beneficial effects on multiple systems, including the brain, kidneys, reproductive system, and the cardiorespiratory system. The aim of this study was the development of liposomal formulations of reduced and oxidized Relaxin-2, as well as a modified form of the reduced peptide achieved through conjugation with the hydrophobic molecule palmitic acid, in order to prolong their duration of action in cells. As a first step, the reduced form of Relaxin-2, conjugated with a fluorescent agent to improve its detectability, was investigated by comparing two encapsulation techniques in liposomal carriers: active loading and the dehydration–rehydration vesicle (DRV) method. It was demonstrated that the latter method achieved enhanced encapsulation efficiency compared to active loading for a specific lipid composition. Subsequently, this method was employed in a new study aimed at identifying the optimal encapsulation across a range of lipid compositions. In addition, the same lipid compositions of the liposomal carriers were examined for prolonged drug retention in release experiments. The studies showed that liposomal carriers containing a negatively charged lipid exhibited higher encapsulation efficiency compared to the other formulations. Furthermore, these carriers displayed a greater percentage of drug retention over a defined study period relative to the other liposomal systems. Subsequently, liposomal formulations of reduced and oxidized Relaxin-2 were compared in terms of optimal biomolecule encapsulation. The formulations exhibiting optimal encapsulation, as well as the free reduced and oxidized Relaxin-2 molecules, were evaluated for their stability in the presence of PBS and 80:20 (FBS:PBS). Finally, with the aim of investigating prolonged cellular activity, a comparison was conducted between the free forms of reduced, oxidized, and palmitoyl Relaxin-2, as well as the corresponding liposomal formulations with the optimal lipid compositions, which were shown to be more stable in the aforementioned media. The presence of a negatively charged lipid confirmed the findings of the previously mentioned studies using RLX2–FITC liposomal formulations, exhibiting a higher encapsulation efficiency. Regarding stability, liposomal carriers of both oxidized and reduced RLX2 showed improved stability compared to the non-encapsulated peptides in the presence of FBS. The biological activity of the free peptides demonstrated higher activity for the reduced form compared to the other two forms. Concerning the biological activity of the two encapsulated forms (reduced and oxidized RLX2) within the same liposomal carriers, the protective effect of encapsulation was highlighted. With respect to palmitoyl RLX2, no substantial difference in activity was observed between the encapsulated and non-encapsulated molecule; however, although the molecule initially exhibited low activity levels, its activity was maintained for a duration of thirty days.

Η νανοτεχνολογία φαρμάκων είναι ευρύτερο πεδίο επιστημών που προέκυψε από συνέργεια πεδίων όπως οι επιστήμες υγείας και φαρμάκων, η επιστήμη της μοριακής χημείας ακόμα και η μηχανική. Έχει συμβάλει στη βελτίωση της σταθερότητας των θεραπευτικών ουσιών και στην εξειδικευμένη στόχευσή τους στην πάσχουσα περιοχή. Έχουν προταθεί αρκετοί τύποι νανοσωματιδίων για τον εγκλωβισμό δραστικών ουσιών. Παράλληλα έχουν πραγματοποιηθεί μελέτες για την τροποποίηση δραστικών ουσιών με στόχο την παρατεταμένη δράση τους, μέσω της βελτιστοποίησης της σταθερότητάς τους στο κυκλοφοριακό σύστημα. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η Ρελαξίνη 2 (RLX2), μια πολυλειτουργική ορμόνη της οικογένειας των ινσουλινοειδών. Το πεπτίδιο αυτό έχει θετική επίδραση σε πολλά συστήματα όπως στον εγκέφαλο, στους νεφρούς, στο αναπαραγωγικό και στο καρδιοαναπνευστικό σύστημα. Στόχος ήταν η ανάπτυξη λιποσωμικών μορφών ανηγμένης και οξειδωμένης Ρελαξίνης 2, καθώς και τροποποιημένης μορφής της ανηγμένης με σύζευξη ενός υδρόφοβου μορίου παλμιτικού οξέος για την παράταση της διάρκειας δράσης τους σε κύτταρα. Αρχικά μελετήθηκε η ανηγμένη μορφή, συζευγμένη με φθορίζουσα ομάδα για την καλύτερη ανιχνευσιμότητά της, συγκρίνοντας δυο τεχνικές εγκλωβισμού της, την ενεργό φόρτωση και την μέθοδο αφυδατωμένων επανασυσταμένων κυστιδίων σε λιποσωμικούς φορείς. Αποδείχθηκε ότι η δεύτερη μέθοδος είχε βελτιωμένους εγκλωβισμούς σε σχέση με την πρώτη μέθοδο σε συγκεκριμένη λιπιδική σύσταση. Ακολούθως η μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε σε νέα μελέτη για την εύρεση του βέλτιστου εγκλωβισμού σε σειρά λιπιδικών συστάσεων. Επιπλέον μελετήθηκαν οι ίδιες λιπιδικές συστάσεις λιποσωμικών φορέων, για την παρατεταμένη κατακράτηση του φαρμάκου σε πειράματα απελευθέρωσης. Οι μελέτες έδειξαν ότι οι λιποσωμικοί φορείς με αρνητικά φορτισμένο λιπίδιο είχαν αυξημένο εγκλωβισμό, συγκριτικά με τους υπόλοιπους φορείς. Επίσης εμφάνισαν μεγαλύτερο ποσοστό κατακράτησης φαρμάκου σε δεδομένο χρονικό διάστημα μελέτης, σε σύγκριση με τους άλλους λιποσωμικούς φορείς. Στη συνέχεια έγινε σύγκριση λιποσωμικών μορφών ανηγμένης και οξειδωμένης Ρελαξίνης 2, για το βέλτιστο εγκλωβισμό των βιομορίων. Οι φορείς με το βέλτιστο εγκλωβισμό καθώς και τα ελεύθερα μόρια ανηγμένης και οξειδωμένης Ρελαξίνης 2 αξιολογήθηκαν για τη σταθερότητά τους υπό την παρουσία PBS και 80:20 (FBS:PBS). Τέλος με στόχο τη μελέτη της παράτασης δράσης σε κύτταρα, έγινε σύγκριση των ελεύθερων μορφών ανηγμένης, οξειδωμένης και παλμιτόυλο Ρελαξίνης 2, καθώς και των βέλτιστων λιπιδικών συστάσεων των λιποσωμικών μορφών τους, που αποδείχθηκαν σταθερότερες στα προαναφερθέντα μέσα. Η παρουσία αρνητικά φορτισμένου λιπιδίου επιβεβαίωσε τα ευρήματα των μελετών με λιποσωμικές μορφές RLX2 – FITC, που προαναφέρθηκαν, παρουσιάζοντας μεγαλύτερο ποσοστό εγκλωβισμού. Σε σχέση με τη σταθερότητα, στους λιποσωμικούς φορείς οξειδωμένης και ανηγμένης μορφής RLX2 παρατηρήθηκε βελτιωμένη σταθερότητα έναντι των μη εγκλωβισμένων πεπτιδίων υπό την παρουσία FBS. Η δραστικότητα πεπτιδίων ως μη εγκλωβισμένων, εμφάνισε υψηλότερη δραστικότητα της ανηγμένης έναντι των άλλων δύο μορφών. Σχετικά με τη βιολογική δραστικότητα των δύο εγκλωβισμένων μορφών για τους ίδιους λιποσωμικούς φορείς (ανηγμένης και οξειδωμένης RLX2), αναδεικνύεται η προστασία των πεπτιδίων. Όσον αφορά στην παλμιτόϋλο RLX2 δεν υπάρχει ουσιαστική διαφορά στη δραστικότητα του εγκλωβισμένου σε σχέση με το μη εγκλωβισμένο μόριο, ενώ η δραστικότητα του μορίου ξεκινάει από χαμηλά επίπεδα δραστικότητας, αλλά διατηρείται για διάρκεια τριάντα ημερών.