Μελέτης επίδρασης φυτικών παραγόντων στη μη-αλκοολική νόσο του ήπατος

Abstract

Introduction: Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is the leading cause of chronic liver disease in Western countries, with increasing prevalence attributed to rising obesity rates, diabetes mellitus, and metabolic syndrome. NAFLD encompasses a spectrum of clinical manifestations ranging from hepatic steatosis to more severe conditions such as non-alcoholic steatohepatitis (NASH), which can progress to cirrhosis or hepatocellular carcinoma. The pathophysiology of NAFLD is multifactorial, primarily involving insulin resistance, oxidative stress, and inflammation. The aim of this study was to investigate the effects of natural compounds silibinin and quercetin on NAFLD, emphasizing the reduction of steatohepatitis and NAFLD Activity Score (NAS), and evaluating molecular markers of autophagy through immunohistochemistry and Western blot analysis. Materials & Methods: Seventy-one male C57BL/6J (wild type) mice were subjected to NAFLD induction through a high-fat diet (HFD) for 12 weeks. The animals were then randomized into six groups. The first group was euthanized after 12 weeks (Baseline, n=11). The remaining mice continued on HFD for additional 4 weeks, receiving the fol-lowing interventions: a. water for injection (Control, n=12), b. SLB-HP-β-CD at 2.5 mg/kg (SLB1, n=12), c. SLB-HP-β-CD at 5 mg/kg (SLB2, n=12), d. QUE-HP-β-CD at 10 mg/kg (QUE, n=12), e. HP-β-CD at 46.67 mg/kg (HP-β-CD, n=12). Liver tissues underwent histological analysis for NAFLD Activity Score (NAS) assessment. Immunohistochemical analysis and Western blot analysis followed to evaluate key biomarkers for autophagy and lipid metabolism regulation (Beclin1, LCA, SQSTM1, PLIN3, CD36). Results: Low-dose silibinin treatment reduced NAS from 5.83±1.27 to 5.42±1.17, while high-dose silibinin further decreased NAS to 4.50±1.57. Steatohepatitis incidence significantly decreased from 83.3% in the control group to 50% in the low-dose group and 33.3% in the high-dose group. Quercetin treatment also reduced NAS to 4.75±1.06, with steatohepatitis incidence significantly reduced to 33.3%. Beclin1 exhibited strong expression in 74.6% of the animals, with no significant difference among groups. In contrast, LC3 expression was significantly lower in animals with NASH (OR: 0.14, 95% CI: 0.05–0.40, p<0.01). SQSTM1 showed significantly stronger expression in animals with fatty liver compared to those with NASH (OR: 4.50, 95% CI: 1.63–12.39, p<0.01). PLIN3 expression remained stable across groups, whereas CD36 showed a non-significant trend towards increased weak expression in NASH.In Western blot analysis, LC3A-I was primarily detected in the cytoplasmic fraction (SP). Conversely, LC3B-I was detected in both cellular fractions across all groups, with LC3B-II primarily localized in the P fraction. SQSTM1 expression significantly increased in the P fraction of the Control and QUE groups, while a significant decrease was observed in the SP fraction of the SLB1 group. Conclusions: Silibinin and Quercetin demonstrate significant therapeutic efficacy against NAFLD, reducing hepatic steatosis and disease severity. These compounds represent promising therapeutic options for managing NAFLD by enhancing autophagy. Further research is required to clarify the molecular mechanisms of their action and to determine optimal dosing for clinical application.

Εισαγωγή: Η μη αλκοολική λιπώδης νόσος του ήπατος (Non-alcoholic Fatty Liver Disease - NAFLD) αποτελεί τη συχνότερη αιτία χρόνιας ηπατικής νόσου στις ανεπτυγμένες χώρες, με αυξανόμενη επίπτωση λόγω της αύξησης της συχνότητας εμφάνισης της παχυσαρκίας, του σακχαρώδους διαβήτη και του μεταβολικού συνδρόμου. Η NAFLD περιλαμβάνει ποικίλες κλινικές εκδηλώσεις από την ηπατική στεάτωση έως σοβαρότερες μορφές όπως η στεατοηπατίτιδα (NASH), η οποία μπορεί να εξελιχθεί σε κίρρωση ή ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα. Το παθοφυσιολογικό υπόβαθρο της νόσου είναι πολυπαραγοντικό, με κύριους μηχανισμούς την αντίσταση στην ινσουλίνη, το οξειδωτικό στρες και τη φλεγμονή. Σκοπός της μελέτης ήταν η διερεύνηση της επίδρασης των φυτικών παραγόντων, σιλιμπιλίνη και κερκετίνη, στη NAFLD, με έμφαση στη μείωση της στεατοηπατίτιδας και του NAFLD Activity Score (NAS), καθώς και στην αξιολόγηση μοριακών δεικτών αυτοφαγίας μέσω ανοσοϊστοχημείας και Western blot. Υλικό & Μέθοδος: Στη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν 71 αρσενικοί μύες του γένους C57BL/6J (wild type) που υποβλήθηκαν σε πρόκληση NAFLD μέσω διατροφής υψηλής σε λιπαρά (High Fat Diet – HFD) για 12 εβδομάδες. Στη συνέχεια τα πειραματόζωα τυχαιοποιήθηκαν σε 6 ομάδες. Η πρώτη ομάδα θανατώθηκε με το πέρας των 12 εβδομάδων (Baseline, n=11). Τα υπόλοιπα πειραματόζωα για τις επόμενες 4 εβδομάδες συνέχισαν την HFD και έλαβαν τις ακόλουθες παρεμβάσεις α. απλό ενέσιμο ύδωρ – water for injection (Control, n=12), β. SLB-HP-β-CD2.5 mg/kg (SLB1, n=12), γ. SLB-HP-β-CD σε δόση 5 mg/kg (SLB2, n=12), δ. QUE-HP-β-CD σε δόση 10 mg/kg (QUE, n=12), ε. HP-β-CD 46.67 mg/kg (HP-β-CD, n=12).Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ιστολογική ανάλυση των ηπατικών παρεγχυμάτων με αξιολόγηση του NAFLD Activity Score (NAS). Ακολούθησε ανοσοϊστοχημική ανάλυση και ανασοαποτύπωση κατά Western για ανάλυση της έκφρασης κρίσιμων βιοδεικτών της αυτοφαγίας και της ρύθμισης του μεταβολισμού των λιπιδίων (Beclin1, LCA, SQSTM1, PLIN3, CD36). Αποτελέσματα: Η θεραπεία με χαμηλή δόση σιλιμπιλίνης μείωσε το NAS από 5.83±1.27 σε 5.42±1.17, ενώ η υψηλή δόση σιλιμπιλίνης μείωσε περαιτέρω το NAS σε 4.50±1.57. Η επίπτωση της στεατοηπατίτιδας μειώθηκε σημαντικά από 83.3% στην ο-μάδα control σε 50% στην ομάδα χαμηλής δόσης και 33.3% στην ομάδα υψηλής δόσης. Η θεραπεία με κερκετίνη μείωσε επίσης το NAS σε 4.75±1.06, ενώ η επίπτωση της στεατοηπατίτιδας μειώθηκε σημαντικά στο 33.3%.Η Beclin1 παρουσίασε ισχυρή έκφραση στο 74.6% των πειραματοζώων, χωρίς στατιστικά σημαντική διαφορά ανάμεσα στις ομάδες. Αντίθετα, η έκφραση της LC3 ήταν σημαντικά μειωμένη στα πειραματόζωα με NASH (OR: 0.14, 95% CI: 0.05 – 0.40, p-value: <0.01). Αντίστοιχα για την SQSTM1 παρατηρήθηκε ισχυρή έκφραση στα πειραματόζωα με λιπώδες ήπαρ έναντι σε αυτά με NASH (OR: 4.50, 95% CI: 1.63–12.39, p-value: <0.01). Αντίθετα, η έκφραση της PLIN3 παρέμεινε σταθερή μεταξύ των δύο ομά-δων, ενώ η CD36 παρουσίασε επίσης τάση αυξημένης ασθενούς έκφρασης σε έδαφος NASH χωρίς όμως να εμφανίζει στατιστικά σημαντική διαφορά.Στην ανοσοαποτύπωση κατά Western, η LC3A-I ανιχνεύθηκε κυρίως στο κυτταροπλασματικό κλάσμα (SP). Αντίθετα, η LC3B-I εντοπίστηκε σε αμφότερα τα κυτταρικά κλάσματα σε όλες τις ομάδες, ενώ Η LC3B-II συγκεντρώθηκε κυρίως στο κλάσμα P. Η έκφραση της SQSTM1 παρουσίασε στατιστικά σημαντική αύξηση στο κλάσμα P στις ομάδες Control και QUE, ενώ στην ομάδα SLB1 παρατηρήθηκε σημαντική μείωση στο κλάσμα SP. Συμπεράσματα: Η σιλιμπιλίνη και η κερκετίνη παρουσιάζουν σημαντική θεραπευτική δράση έναντι της NAFLD περιορίζοντας τη στεάτωση και μειώνοντας την βαρύτητα της νόσου. Οι ουσίες αυτές αποτελούν υποσχόμενες θεραπευτικές επιλογές για τη διαχείριση της NAFLD μέσω της ενίσχυσης της αυτοφαγίας. Περισσότερη έρευνα απαιτείται τόσο για τη διασαφήνιση των μοριακών μηχανισμών δράσης τους, όσο και για τον καθορισμό της βέλτιστης δοσολογίας τους για την κλινική πράξη.