Growth plate mechanobiology and control of endochondral ossification processes

Abstract

Osteoarthritis (OA) and failed bone healing both involve inappropriate control of endochondral ossification (EO), a process critical to growing skeletal element elongation; OA recapitulates EO ‘growth’ features, while inefficient EO delays fracture repair. EO exhibits significant interplay with local biomechanics and this thesis seeks to pinpoint how these mechanical cues regulate EO during bone lengthening to identify new ways to boost fracture healing and prevent OA. My exploration of μCT images from studies using the non-invasive mouse tibia loading model revealed that short-term application of dynamic compressive load promotes long-term increases in longitudinal tibial growth in mice nearing skeletal maturity, whilst load-related length changes were not observed within the 2-week-long loading session. This suggests the triggering of acute responses in the growth plate (GP) during loading that culminate later as sustained EO acceleration. To define these mechanisms, load-strain relationships in young, fast-growing mice were evaluated, using identical loading regimens. To achieve this goal, immunofluorescently detected 5-bromo-2´-deoxyuridine (BrdU) and/or 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU) were used to detect a rapid response in GP to applied dynamic loading. Quantification of the scale and distribution of load-induced changes in GP proliferation (vs. non-loaded contralateral tibia) revealed rapid increases consistent with altered resident chondrocyte behaviour, supporting the notion that dynamic mechanical stimuli promote longitudinal growth and that they may also contribute to the acquisition of certain EO behaviours in OA articular cartilage. The response to applied dynamic loading was also investigated in Ift88 gene-deleted mice to evaluate the connection between primary cilia, mechanotransduction, and long bone formation. To address this, we used mice in which the ciliary gene, intraflagellar transport protein 88 (Ift88 flox) is conditionally (tamoxifen-inducible) deleted in the juvenile/adolescent skeleton using a cartilage-specific, inducible Cre (AcanCreERT2). This showed that GP dynamics are particularly sensitive to mechanical control of ER signaling, and that subsequent tamoxifen-mediated, aggrecan-Cre targeted deletion of Ift88 blunts this sensitivity, relying on Ift88 and primary cilia for their transduction. These findings likely highlight the critical function that ER plays in the GP, aiding longitudinal bone development and delaying growth cessation and GP fusion. Aligned with prior work showing that epiphyseal GP bone ‘bridging’ is intimately linked with aberrant EO behaviours in articular cartilage of the OA-prone STR/Ort mice, my studies also explored mechanisms controlling bridge development. Number and areal density of GP bridges was assessed in different mouse strains (C57Bl/6J, STR/Ort, CBA, DBA), ages (skeletal young, mature and old), sex, OA susceptibility (C57Bl/6J, STR/Ort) and following application of loading and administration of pharmacological substances (PTH, SFX-01, tamoxifen). One of the features revealed by these studies was that applying load reduced areal bridge density and modified distribution, implying that their production was mechano-regulated. Mechanical function, however, may be lost due to structural changes caused by aging or disease. As a result, my studies have sought to exploit real-time high-resolution synchrotron scanning of loaded GPs to quantify patterns of strain by digital volume correlation. These data revealed how initial deformation across the intact joint region is translated into strain accumulation in the GP region and how this is reduced dramatically in mice as they reach skeletal maturity. Mapping of bridge position under these load-related GP strain fields, explains the mechanics of endochondral ‘growth’ behaviour more thoroughly. Together, these studies established how maturation and ageing influence GP deformation upon loading and allowed their relationships with load-induced changes in EO, GP chondrocyte behaviour and bridging to be explored for the first time.

Η οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ) και η αποτυχημένη επούλωση των οστών περιλαμβάνουν ακατάλληλο έλεγχο της ενδοχονδρικής οστεοποίησης (ΕΟ), μιας διαδικασίας κρίσιμης για την επιμήκυνση του αναπτυσσόμενου σκελετικού στοιχείου. Η ΟΑ ανακεφαλαιώνει τα χαρακτηριστικά «ανάπτυξης» της ΕΟ, ενώ η αναποτελεσματική ΕΟ καθυστερεί την αποκατάσταση καταγμάτων. Η ΕΟ παρουσιάζει σημαντική αλληλεπίδραση με την τοπική βιομηχανική και αυτή η διατριβή επιδιώκει να εντοπίσει πώς αυτά τα μηχανικά ερεθίσματα ρυθμίζουν την ΕΟ κατά την επιμήκυνση του οστού, ώστε να εντοπίσει νέους τρόπους για την ενίσχυση της επούλωσης καταγμάτων και την πρόληψη της ΟΑ. Η εξερεύνησή μου σε εικόνες μCT από μελέτες που χρησιμοποιούν το μη επεμβατικό μοντέλο φόρτισης κνήμης ποντικού αποκάλυψε ότι η βραχυπρόθεσμη εφαρμογή δυναμικού συμπιεστικού φορτίου προάγει μακροπρόθεσμες αυξήσεις στη διαμήκη ανάπτυξη της κνήμης σε ποντίκια που πλησιάζουν στην σκελετική ωριμότητα, ενώ δεν παρατηρήθηκαν αλλαγές στο μήκος που σχετίζονται με το φορτίο εντός της συνεδρίας φόρτισης 2 εβδομάδων. Αυτό υποδηλώνει την ενεργοποίηση οξέων αποκρίσεων στην πλάκα ανάπτυξης (ΠΑ) κατά τη διάρκεια της φόρτισης που κορυφώνονται αργότερα ως παρατεταμένη επιτάχυνση της ΕΟ. Για να οριστούν αυτοί οι μηχανισμοί, αξιολογήθηκαν οι σχέσεις φορτίου-παραμόρφωσης σε νεαρά, ταχέως αναπτυσσόμενα ποντίκια, χρησιμοποιώντας πανομοιότυπα σχήματα φόρτισης. Για την επίτευξη αυτού του στόχου, χρησιμοποιήθηκαν ανοσοφθοριστικά ανιχνευμένες 5-βρωμο-2'-δεοξυουριδίνες (BrdU) ή/και 5-αιθυνυλ-2'-δεοξυουριδίνες (EdU) για την ανίχνευση μιας ταχείας απόκρισης στην ΠΑ στην εφαρμογή δυναμικής φόρτισης. Η ποσοτικοποίηση της κλίμακας και της κατανομής των αλλαγών στον πολλαπλασιασμό της ΠΑ που προκαλούνται από το φορτίο (έναντι μη φορτισμένης ετερόπλευρης κνήμης) αποκάλυψε ταχείες αυξήσεις που συνάδουν με την αλλοιωμένη συμπεριφορά των χονδροκυττάρων, υποστηρίζοντας την άποψη ότι τα δυναμικά μηχανικά ερεθίσματα προάγουν τη διαμήκη ανάπτυξη και ότι μπορούν επίσης να συμβάλουν στην απόκτηση ορισμένων συμπεριφορών EO στον αρθρικό χόνδρο με οστεοαρθρίτιδα. Η απόκριση στην εφαρμογή δυναμικής φόρτισης διερευνήθηκε επίσης σε ποντίκια με διαγραφή του γονιδίου Ift88 για να αξιολογηθεί η σύνδεση μεταξύ των πρωτογενών κροσσών, της μηχανικής μεταγωγής και του σχηματισμού μακρών οστών. Για να αντιμετωπίσουμε αυτό το πρόβλημα, χρησιμοποιήσαμε ποντίκια στα οποία το γονίδιο της κροσσωτής μεμβράνης, η πρωτεΐνη ενδοφλεβικής μεταφοράς 88 (Ift88 flox), έχει διαγραφεί υπό όρους (επαγόμενη από ταμοξιφαίνη) στον νεανικό/εφηβικό σκελετό χρησιμοποιώντας μια ειδική για τον χόνδρο, επαγώγιμη Cre (AcanCreERT2). Αυτό έδειξε ότι η δυναμική των ΠΑ είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη στον μηχανικό έλεγχο της σηματοδότησης του estrogen receptor (ER), και ότι η επακόλουθη διαγραφή του Ift88 που προκαλείται από την ταμοξιφαίνη, στοχευμένη από την aggrecan-Cre, αμβλύνει αυτήν την ευαισθησία, βασιζόμενη στην Ift88 και τους πρωτογενείς κροσσούς για τη μεταγωγή τους. Αυτά τα ευρήματα πιθανώς υπογραμμίζουν την κρίσιμη λειτουργία που παίζει ο ER στην ΠΑ, βοηθώντας στην ανάπτυξη του διαμήκους οστού και καθυστερώντας την παύση της ανάπτυξης και τη σύντηξη της ΠΑ.Σύμφωνα με προηγούμενες εργασίες που δείχνουν ότι η «γεφύρωση» του οστού της επιφύσης της ΠΑ συνδέεται στενά με ανώμαλες συμπεριφορές EO στον αρθρικό χόνδρο των ποντικών STR/Ort με τάση για οστεοαρθρίτιδα, οι μελέτες μου διερεύνησαν επίσης μηχανισμούς που ελέγχουν την ανάπτυξη της γέφυρας. Ο αριθμός και η πυκνότητα των γεφυρών ΠΑ αξιολογήθηκαν σε διαφορετικά στελέχη ποντικών (C57Bl/6J, STR/Ort, CBA, DBA), ηλικίες (σκελετικοί νέοι, ώριμοι και ηλικιωμένοι), φύλο, ευαισθησία στην οστεοαρθρίτιδα (C57Bl/6J, STR/Ort) και μετά την εφαρμογή φόρτωσης και χορήγησης φαρμακολογικών ουσιών (PTH, SFX-01, ταμοξιφαίνη). Ένα από τα χαρακτηριστικά που αποκαλύφθηκαν από αυτές τις μελέτες ήταν ότι η εφαρμογή φορτίου μείωσε την πυκνότητα της γεφύρας και τροποποίησε την κατανομή της, υποδηλώνοντας ότι η παραγωγή τους ρυθμιζόταν μηχανικά. Ωστόσο, η μηχανική λειτουργία μπορεί να χαθεί λόγω δομικών αλλαγών που προκαλούνται από τη γήρανση ή ασθένειες. Ως αποτέλεσμα, οι μελέτες μου επιδίωξαν να αξιοποιήσουν τη σάρωση συγχρότρον υψηλής ανάλυσης σε πραγματικό χρόνο των φορτισμένων ΠΑ για να ποσοτικοποιήσουν τα πρότυπα παραμόρφωσης μέσω ψηφιακής συσχέτισης όγκου. Αυτά τα δεδομένα αποκάλυψαν πώς η αρχική παραμόρφωση στην άθικτη περιοχή της άρθρωσης μεταφράζεται σε συσσώρευση παραμόρφωσης στην περιοχή ΠΑ και πώς αυτή μειώνεται δραματικά στα ποντίκια καθώς φτάνουν στην σκελετική ωριμότητα. Η χαρτογράφηση της θέσης της γέφυρας κάτω από αυτά τα πεδία παραμόρφωσης της ΠΑ που σχετίζονται με το φορτίο, εξηγεί πιο διεξοδικά τους μηχανισμούς της ενδοχονδρικής συμπεριφοράς «ανάπτυξης». Μαζί, αυτές οι μελέτες διαπίστωσαν πώς η ωρίμανση και η γήρανση επηρεάζουν την παραμόρφωση της ΠΑ κατά τη φόρτιση και επέτρεψαν να διερευνηθούν για πρώτη φορά οι σχέσεις τους με τις αλλαγές που προκαλούνται από το φορτίο στην EO, στη συμπεριφορά των χονδροκυττάρων της ΠΑ και της γεφύρωσης.