Imaging extracellular vesicles arising from apoptotic tumour cells for cancer diagnosis and monitoring

Abstract

As a large part of all health-related research is focused on cancer, and with several diagnostic and therapeutic procedures continuously emerging, the fact that this disease remains mostly uncured often seems overwhelming. Cancer is a disease with extremely heterogenous causes and biologic backgrounds, and multiple mechanisms have been identified as cancer-promoting, acting on several stages of the tumour progression. Among numerous other networks, cancer cells use their own death in order to signal an urgency for survival to their neighbouring cells. It has been observed that while a cancer cell is undergoing apoptosis, it can release signals which upon receipt by surrounding cells can promote the growth of tumour. Apoptosis is a form of programmed cell death with diverse roles in the tumour microenvironment and emerging data indicate that, besides its role in tumour suppression, it can also promote oncogenic proliferation. Highly aggressive tumours such as Burkitt Lymphoma (BL) show high levels of apoptosis, which has a diagnostic and prognostic value for classifying and staging the disease. The network of regeneration and tissue repair mechanisms driven by cell-death has been named as the “onco-regenerative niche” by our group, and it is hypothesized that amongst other elements, extracellular vesicles (EVs) are key mediators of apoptotic cell-derived tumour microenvironment signals. EV are membrane delimited structures secreted by cells, containing multiple types of bioactive material, including markers of the tissue they originate from. They are released by almost all cells and during several phases of the cell life cycle. EV show numerous applications in diagnostics, and there is an increasing interest in their biological functions. However, mainly because of their small size and heterogeneity, there are challenges associated with their analysis, and although EV are gaining popularity in clinical diagnostic practice, the guidelines for analytic procedures have not been established to date. Because the vesicles are much smaller than cells and fall in the category of nanoparticles, the methods which can be applied for their analysis are dedicated to smaller entities or are special adaptations of other methods routinely used for larger particles such as cells. Here, we report on EV released by apoptotic BL cells (Apo-EV) in relation to their potential use as cancer biomarkers in lymphoma. The hypothesis of this project examines the Apo-EVs as to their distinct structural and biochemical characteristics which can be used in the context of disease diagnosis and monitoring. As Apo-EVs can reach the main blood circulation, the analysis of Apo-EVs in patients can provide with information about the stages and the progression of the disease. The two main axes this work move around on are firstly, the structural and biochemical analysis of the Apo-EVs, in order to examine their special molecular characteristics which render those different from other EVs which are not related to apoptosis and secondly, the study of how Apo-EVs interact with cells present in the blood and whether their cargo can be transferred to the second. Those two sets of studies can provide a better understanding of Apo-EV and their roles, aiming at contributing towards the development of a disease monitoring platform. This project is focused on analytical platforms and techniques which can be applied to the nano-scale for imaging EV in pre-clinical research and with the potential for application on patient samples. In particular, EV released in vitro by Burkitt Lymphoma cells undergoing apoptosis upon UV irradiation are used throughout this study. Basic physical properties of Apo-EV such as structure, size distribution, surface charge and membrane fluidity are discussed using Cryo Electron Microscopy (EM) and tomography, Nanoparticle Tracking Analysis, Dynamic Light Scattering and fluorescence anisotropy respectively. For phenotypic analysis we apply immunocapture and flow cytometry, immunogold labelling on transmission EM, fluorescence microscopy and quantitative PCR. The second part of the analysis consists of a study of the interaction of Apo-EV with blood components such as platelets, leukocytes and red cells, in order to understand their effects in the circulation and therefore their potential for analysis in blood samples. For this purpose, cells and platelets from human blood were co-incubated with Apo-EVs in order to examine the uptake and the possibility of Apo-EV cargo delivery intracellularly. Looking at the differences between Apo- and non-Apo-EV, the Apo-EV have a larger diameter, while structurally, the two populations are not different. However, we have identified distinct Apo-EV markers such as active caspase 3 and histones, or DNA and small non-coding RNA-Y. There is also a strong interaction of EV with platelets and leukocytes but not with red cells, indicating potential mechanisms of transfer of EV cargo in the circulation. It was also found that this interaction does not only concern the surface of the cells, but EVs can enter the platelets or cells, which supports the hypothesis that their special biochemical cargo can be transferred inside those cells. It is concluded that for the characterization of the heterogenous Apo-EV populations, comparison of results from of each method is essential for choosing the appropriate combination of analytical tools. Finally, we consider that the monitoring free circulating Apo-EV or blood cells with which they have interacted is a promising approach to improve cancer diagnosis, prognosis and evaluation of therapeutic response.

Καθώς μεγάλο μέρος της έρευνας που σχετίζεται με την υγεία επικεντρώνεται στον καρκίνο, και με αρκετές διαγνωστικές και θεραπευτικές διαδικασίες να αναδύονται συνεχώς, το γεγονός ότι αυτή η ασθένεια παραμένει ως επί το πλείστον αθεράπευτη συχνά φαίνεται συντριπτικό. Ο καρκίνος είναι μια ασθένεια με εξαιρετικά ετερογενείς αιτίες και βιολογικό υπόβαθρο, και πολλαπλοί μηχανισμοί έχουν αναγνωριστεί ως προαγωγείς του καρκίνου, δρώντας σε διάφορα στάδια της εξέλιξης του όγκου. Μεταξύ πολλών άλλων δικτύων, τα καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιούν τον δικό τους θάνατο για να σηματοδοτήσουν μια επείγουσα ανάγκη επιβίωσης στα γειτονικά τους κύτταρα. Έχει παρατηρηθεί ότι ενώ ένα καρκινικό κύτταρο υφίσταται απόπτωση, μπορεί να απελευθερώσει σήματα τα οποία κατά την παραλαβή τους από τα περιβάλλοντα κύτταρα μπορούν να προωθήσουν την ανάπτυξη του όγκου. Η απόπτωση είναι μια μορφή προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου με ποικίλους ρόλους στο μικροπεριβάλλον του όγκου και τα αναδυόμενα δεδομένα δείχνουν ότι, εκτός από τον ρόλο της στην καταστολή του όγκου, μπορεί επίσης να προωθήσει τον ογκογόνο πολλαπλασιασμό. Οι εξαιρετικά επιθετικοί όγκοι όπως το λέμφωμα Burkitt (BL) εμφανίζουν υψηλά επίπεδα απόπτωσης, η οποία έχει διαγνωστική και προγνωστική αξία για την ταξινόμηση και τη σταδιοποίηση της νόσου. Το δίκτυο μηχανισμών αναγέννησης και επιδιόρθωσης ιστών που καθοδηγούνται από τον κυτταρικό θάνατο έχει ονομαστεί από την ομάδα μας ως «ογκο-αναγεννητική φωλεά» και υποτίθεται ότι, μεταξύ άλλων στοιχείων, τα εξωκυτταρικά κυστίδια (EVs) είναι βασικοί μεσολαβητές των σημάτων μικροπεριβάλλοντος όγκου που προέρχονται από αποπτωτικά κύτταρα. Τα EV είναι δομές που οριοθετούνται από μεμβράνη και εκκρίνονται από τα κύτταρα, οι οποίες περιέχουν πολλαπλούς τύπους βιοδραστικού υλικού, συμπεριλαμβανομένων δεικτών του ιστού από τον οποίο προέρχονται. Απελευθερώνονται από σχεδόν όλα τα κύτταρα και κατά τη διάρκεια διαφόρων φάσεων του κύκλου ζωής των κυττάρων. Τα EV παρουσιάζουν πολυάριθμες εφαρμογές στη διαγνωστική και υπάρχει αυξανόμενο ενδιαφέρον για τις βιολογικές τους λειτουργίες. Ωστόσο, κυρίως λόγω του μικρού τους μεγέθους και της ετερογένειας, υπάρχουν προκλήσεις που σχετίζονται με την ανάλυσή τους και, παρόλο που τα EV κερδίζουν δημοτικότητα στην κλινική διαγνωστική πρακτική, οι κατευθυντήριες γραμμές για τις αναλυτικές διαδικασίες δεν έχουν καθοριστεί μέχρι σήμερα. Επειδή τα κυστίδια είναι πολύ μικρότερα από τα κύτταρα και εμπίπτουν στην κατηγορία των νανοσωματιδίων, οι μέθοδοι που μπορούν να εφαρμοστούν για την ανάλυσή τους είναι αφιερωμένες σε μικρότερες οντότητες ή είναι ειδικές προσαρμογές άλλων μεθόδων που χρησιμοποιούνται συνήθως για μεγαλύτερα σωματίδια, όπως τα κύτταρα. Εδώ, αναφέρουμε τα EV που απελευθερώνονται από τα αποπτωτικά κύτταρα BL (Apo-EV) σε σχέση με την πιθανή χρήση τους ως βιοδείκτες καρκίνου στο λέμφωμα. Η υπόθεση αυτού του έργου εξετάζει τα Apo-EV ως προς τα διακριτά δομικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά τους, τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν στο πλαίσιο της διάγνωσης και της παρακολούθησης ασθενειών. Καθώς τα Apo-EV μπορούν να φτάσουν στην κύρια κυκλοφορία του αίματος, η ανάλυση των Apo-EV σε ασθενείς μπορεί να παρέχει πληροφορίες σχετικά με τα στάδια και την εξέλιξη της νόσου. Οι δύο κύριοι άξονες στους οποίους κινείται αυτή η εργασία είναι πρώτον, η δομική και βιοχημική ανάλυση των Apo-EV, προκειμένου να εξεταστούν τα ιδιαίτερα μοριακά χαρακτηριστικά τους που τα καθιστούν διαφορετικά από άλλα EV που δεν σχετίζονται με την απόπτωση και δεύτερον, η μελέτη του τρόπου με τον οποίο τα Apo-EV αλληλεπιδρούν με τα κύτταρα που υπάρχουν στο αίμα και κατά πόσον το φορτίο τους μπορεί να μεταφερθεί στο δεύτερο. Αυτά τα δύο σύνολα μελετών μπορούν να παρέχουν καλύτερη κατανόηση των Apo-EV και των ρόλων τους, με στόχο να συμβάλουν στην ανάπτυξη μιας πλατφόρμας παρακολούθησης ασθενειών.Αυτό το έργο επικεντρώνεται σε αναλυτικές πλατφόρμες και τεχνικές που μπορούν να εφαρμοστούν σε νανοκλίμακα για την απεικόνιση EV σε προκλινική έρευνα και με δυνατότητα εφαρμογής σε δείγματα ασθενών. Συγκεκριμένα, σε όλη τη διάρκεια αυτής της μελέτης χρησιμοποιούνται EV που απελευθερώνονται in vitro από κύτταρα λεμφώματος Burkitt που υφίστανται απόπτωση κατά την υπεριώδη ακτινοβολία. Βασικές φυσικές ιδιότητες των Apo-EV, όπως η δομή, η κατανομή μεγέθους, το επιφανειακό φορτίο και η ρευστότητα της μεμβράνης, συζητούνται χρησιμοποιώντας Κρυοηλεκτρονική Μικροσκοπία (EM) και τομογραφία, Ανάλυση Παρακολούθησης Νανοσωματιδίων, Δυναμική Σκέδαση Φωτός και ανισοτροπία φθορισμού αντίστοιχα. Για τη φαινοτυπική ανάλυση εφαρμόζουμε ανοσοσύλληψη και κυτταρομετρία ροής, ανοσοχρυσή σήμανση σε ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία μετάδοσης, μικροσκοπία φθορισμού και ποσοτική PCR. Το δεύτερο μέρος της ανάλυσης αποτελείται από μια μελέτη της αλληλεπίδρασης των Apo-EV με συστατικά του αίματος όπως αιμοπετάλια, λευκοκύτταρα και ερυθρά αιμοσφαίρια, προκειμένου να κατανοηθούν οι επιδράσεις τους στην κυκλοφορία και επομένως οι δυνατότητές τους για ανάλυση σε δείγματα αίματος. Για τον σκοπό αυτό, κύτταρα και αιμοπετάλια από ανθρώπινο αίμα συν-επωάστηκαν με Apo-EVs προκειμένου να εξεταστεί η πρόσληψη και η πιθανότητα ενδοκυτταρικής μεταφοράς φορτίου Apo-EV.Εξετάζοντας τις διαφορές μεταξύ Apo- και μη-Apo-EV, τα Apo-EV έχουν μεγαλύτερη διάμετρο, ενώ δομικά, οι δύο πληθυσμοί δεν διαφέρουν. Ωστόσο, έχουμε εντοπίσει διακριτούς δείκτες Apo-EV όπως η ενεργή κασπάση 3 και οι ιστόνες, ή DNA και μικρό μη κωδικοποιητικό RNA-Y. Υπάρχει επίσης μια ισχυρή αλληλεπίδραση των EV με τα αιμοπετάλια και τα λευκοκύτταρα, αλλά όχι με τα ερυθρά αιμοσφαίρια, υποδεικνύοντας πιθανούς μηχανισμούς μεταφοράς φορτίου EV στην κυκλοφορία. Διαπιστώθηκε επίσης ότι αυτή η αλληλεπίδραση δεν αφορά μόνο την επιφάνεια των κυττάρων, αλλά τα EV μπορούν να εισέλθουν στα αιμοπετάλια ή τα κύτταρα, γεγονός που υποστηρίζει την υπόθεση ότι το ειδικό βιοχημικό φορτίο τους μπορεί να μεταφερθεί μέσα σε αυτά τα κύτταρα. Συμπεραίνεται ότι για τον χαρακτηρισμό των ετερογενών πληθυσμών Apo-EV, η σύγκριση των αποτελεσμάτων από κάθε μέθοδο είναι απαραίτητη για την επιλογή του κατάλληλου συνδυασμού αναλυτικών εργαλείων. Τέλος, θεωρούμε ότι η παρακολούθηση των ελεύθερων κυκλοφορούντων Apo-EV ή των αιμοσφαιρίων με τα οποία έχουν αλληλεπιδράσει είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για τη βελτίωση της διάγνωσης του καρκίνου, της πρόγνωσης και της αξιολόγησης της θεραπευτικής απόκρισης.