Human iPSCs-derived 2D and 3D models to study mTOR signalling in health and disease

Abstract

The groundbreaking technology of induced pluripotent stem cells (iPSCs), made by Yamanaka and his team in 2006 and 2007, is a method of reprograming adult cells into a stem-cell-like state. iPSC maintain the ability of self-renewal and differentiation in all of the three germ layers, rendering them highly appealing for application in regenerative medicine, drug screening, cell therapy, and disease modeling. Numerous protocols have been published for the generation of two-dimensional (2D) or three-dimensional (3D) cultures, that recapitulate mature cell types, tissues and organs including specific brain regions. This dissertation is devoted in modeling two of the most common neurodevelopmental and neurodegenerative diseases, Autism Spectrum disorder (ASD) and Parkinson’s disease (PD) respectively, and elucidate their correlation with the regulation and expression of mechanistic target of rapamycin (mTOR). mTOR is a 298 kDa serine/threonine kinase that is a part of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) related family with two divergent complexes, mTOR Complex 1 (mTORC1) and 2 (mTORC2). mTOR controls cell growth, nutrient metabolism, and protein synthesis which are altered in ASD and PD.An overarching theme in both experimental chapters of this thesis is the development and characterization of 2D and 3D models, derived from human iPSC in order to test the central thesis hypothesis. While this thesis is being composed, the UK has become the first country to set firm deadlines for phasing out animal testing, committing to shift entire regulatory endpoints to validated human-relevant methods by 2027 and accelerating a broader transatlantic move toward New Approach Methodologies (NAMs). These developments signal a rapid, coordinated shift in preclinical science from “replace where possible” to “replace on schedule,” with major investments, regulatory momentum, and international alignment already underway. The first part of the present thesis is dedicated to establishing human cerebral organoid and cortical neuron models derived from iPSCs with targeted genome editing to abolish protein expression of the CNTNAP2 gene, associated with ASD. The cerebral organoid model is used to study genetic pathways in early development that are involved in the polygenic nature of ASD. CNTNAP2 KO organoids displayed significant reduction in size at D30, accelerated cell cycle, increased surface folding and ventricular zone (VZ) disorganization. Proteomics analysis revealed disruption in excitatory and inhibitory synaptic pathways, as well as in neurodevelopment, while bulk RNA-seq revealed differentially expressed genes belonging to inhibitory neuron-related gene networks. Interestingly, there was a weak correlation between those datasets, suggesting nuanced translational control mechanisms, and highlighting the crucial role of AKT/mTOR pathway which was upregulated in CNTNAP2 KO organoids. Omics analyses also identified forkhead box G1 (FOXG1) as a top target involved in the development of cortical interneurons. Consistent with this, our model of CNTNAP2 KO organoids showed increased differentiation of gamma-aminobutyric acidergic (GABAergic) interneuron. These findings clarify the role of CNTNAP2 and mTOR pathway in ASD pathophysiology and early cortical development and pave the way for the development of targeted therapies employing cerebral organoids as preclinical models. The second part of this thesis focuses on investigating early pathological mechanisms associated with SNCA gene triplication and subsequent synucleinopathies, and their link to proteostasis, using iPSC derived midbrain organoids carrying an SNCA triplication. SNCA triplication organoids exhibited increased α-synuclein accumulation, neuromelanin deposition, reduction in diameter and projected area at D100. Moreover, they presented activation of mTORC1 (phospho-ribosomal protein S6; rpS6), ERK1/2, AKT and eukaryotic initiation factor 2 alpha (eIF2α) signalling pathways by D100. Proteomic analyses identified upregulation in proteins involved in axonal, cytoskeletal and synaptic development pathways and downregulation in extracellular matrix (ECM) components, such as laminin. Transcriptomics corroborated these findings by showing significant downregulation in the expression of ECM related mRNAs and upregulation of mRNAs encoding for proteins abundant in the perineuronal nets (PNNs). Bulk translatomics of actively translated mRNAs measured by Ribosome profiling revealed modest changes in global translation but uncovered selective translational buffering of neuronal and ECM-associated transcripts. Confocal imaging was utilized to examine the organization of ECM at cellular level and confirmed pronounced enrichment of pericellular and interstitial ECM structure around neurons in SNCA triplication organoids. Interestingly, this phenotype appeared earlier in tyrosine hydroxylase (TH+) neurons compared to microtubule associated protein 2 (MAP2+) cells. An attempt was made to elucidate whether ECM remodeling acts as a neuroprotective or neurodegenerative mechanism through pharmacological inhibition of the ECM, however the results were inconclusive. Dopaminergic neurons were also generated and characterized, but neuronal cultures derived from SNCA Trip iPSCs proved non-viable. All these findings revealed that SNCA triplication induces proteostatic disruption and ECM remodelling prior to neurodegeneration and suggest that altered gene expression and ECM homeostasis may contribute to disease initiation and progression. Targeting these early aberrant mechanisms may offer new therapeutic opportunities for synucleinopathies, such as Parkinson’s disease.

Η πρωτοποριακή τεχνολογία των επαγόμενων πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων (iPSCs), που αναπτύχθηκε από τον Yamanaka και την ομάδα του το 2006 και το 2007, είναι μια μέθοδος επαναπρογραμματισμού ενήλικων κυττάρων σε μια κατάσταση όμοια με αυτή των βλαστικών κυττάρων. Τα iPSCs διατηρούν την ικανότητα αυτοανανέωσης και διαφοροποίησης και προς τις τρεις βλαστικές στιβάδες, χαρακτηριστικά που τα καθιστούν ιδιαίτερα ελκυστικά για εφαρμογές στην αναγεννητική ιατρική, τον έλεγχο φαρμάκων, την κυτταρική θεραπεία και τη μοντελοποίηση ασθενειών. Έχουν δημοσιευθεί πολυάριθμα πρωτόκολλα για τη δημιουργία δισδιάστατων (2D) ή τρισδιάστατων (3D) καλλιεργειών, που αναπαριστούν ώριμους κυτταρικούς τύπους, ιστούς και όργανα, συμπεριλαμβανομένων και συγκεκριμένων περιοχών του εγκεφάλου. Η παρούσα διατριβή αφιερώνεται στη μοντελοποίηση δύο εκ των συχνότερων νευροαναπτυξιακών και νευροεκφυλιστικών ασθενειών, της Διαταραχής Αυτιστικού Φάσματος (ΔΑΦ) και της νόσου Πάρκινσον (ΝΠ), καθώς και στη διαλεύκανση της συσχέτισής τους με τη ρύθμιση και την έκφραση της κινάσης του μηχανιστικού στόχου της ραπαμυκίνης (mTOR). Η mTOR είναι μια κινάση σερίνης/θρεονίνης 298 kDa που συνιστά μέλος της οικογένειας των φωσφατιδυλινοσιτόλης 3-κινασών (PI3K) με δύο διακριτά σύμπλοκα, το σύμπλοκο mTOR 1 (mTORC1) και 2 (mTORC2). Η mTOR ελέγχει την κυτταρική ανάπτυξη, τον μεταβολισμό των θρεπτικών συστατικών και τη σύνθεση πρωτεϊνών, τα οποία επηρεάζονται στη ΔΑΦ και τη ΝΠ. Ένα κεντρικό θέμα και στα δύο πειραματικά κεφάλαια της παρούσας διατριβής είναι η ανάπτυξη και ο χαρακτηρισμός δισδιάστατων και τρισδιάστατων μοντέλων, προερχόμενων από ανθρώπινα iPSC, με στόχο την πειραματική διερεύνηση της κεντρικής υπόθεσης της διατριβής. Την περίοδο που συγγράφεται η παρούσα διατριβή, το Ηνωμένο Βασίλειο έγινε η πρώτη χώρα που θέτει συγκεκριμένα χρονοδιαγράμματα για την κατάργηση των δοκιμών σε ζώα, δεσμευόμενο να μεταφέρει ολόκληρα ρυθμιστικά τελικά σημεία σε επικυρωμένες, ανθρωποκεντρικές μεθόδους έως το 2027 και να επιταχύνει μια ευρύτερη διατλαντική στροφή προς τις Νέες Μεθοδολογίες Προσέγγισης (NAMs). Οι εξελίξεις αυτές σηματοδοτούν μια ταχεία και συντονισμένη αλλαγή στην προκλινική επιστήμη, από το «αντικατάσταση όπου είναι δυνατόν» στο «αντικατάσταση βάσει προγράμματος», με σημαντικές επενδύσεις, ρυθμιστική δυναμική και διεθνή σύγκλιση να είναι ήδη σε εξέλιξη. Το πρώτο μέρος της παρούσας διατριβής είναι αφιερωμένο στη δημιουργία μοντέλων ανθρώπινων εγκεφαλικών οργανοειδών και φλοιωδών νευρώνων που προέρχονται από iPSCs με στοχευμένη επεξεργασία γονιδιώματος για την εξάλειψη της πρωτεϊνικής έκφρασης του γονιδίου CNTNAP2 (CNTNAP2 KO), που σχετίζεται με την ΔΑΦ. Τα CNTNAP2 KO οργανοειδή εμφάνισαν σημαντική μείωση στο μέγεθος τους την 30η ημέρα, επιταχυνόμενο κυτταρικό κύκλο, αυξημένη αναδίπλωση επιφάνειας και αποδιοργάνωση της κοιλιακής ζώνης (VZ). Η πρωτεωμική ανάλυση αποκάλυψε διαταραχή στις διεγερτικές και ανασταλτικές συναπτικές οδούς και στη νευροανάπτυξη, ενώ η ολική αλληλούχιση RNA ανέδειξε διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια που ανήκουν σε ανασταλτικά γονιδιακά δίκτυα σχετιζόμενα με νευρώνες. Είναι ενδιαφέρον ότι υπήρξε μια ασθενής συσχέτιση μεταξύ αυτών των συνολικών δεδομένων, υποδηλώνοντας λεπτούς μηχανισμούς ελέγχου της μετάφρασης και τονίζοντας τον κρίσιμο ρόλο της οδού AKT/mTOR, η οποία ήταν ανοδικά ρυθμισμένη στα οργανοειδή CNTNAP2 KO. Τα αποτελέσματα της ωμικών αναλύσεων αναγνώρισαν επίσης το forkhead box G1 (FOXG1) ως έναν κορυφαίο στόχο που εμπλέκεται στην ανάπτυξη των φλοιωδών ενδιάμεσων νευρώνων, ένα αποτέλεσμα που παρατηρήθηκε στο μοντέλο μας, καθώς τα οργανοειδή CNTNAP2 KO είχαν αυξημένη διαφοροποίηση ενδιάμεσων νευρώνων γ-αμινοβουτυρικού οξέος (GABAergic). Αυτά τα ευρήματα διευκρινίζουν τον ρόλο της CNTNAP2 και του μονοπατιού της mTOR στην παθοφυσιολογία της ΔΑΦ και στην πρώιμη ανάπτυξη του φλοιού, ανοίγοντας το δρόμο για την ανάπτυξη στοχευμένων θεραπειών που χρησιμοποιούν εγκεφαλικά οργανοειδή ως προκλινικά μοντέλα. Το δεύτερο τμήμα αυτής της διατριβής επικεντρώνεται στη διερεύνηση τω πρώιμων παθολογικών μηχανισμών που σχετίζονται με τον τριπλασιασμό του γονιδίου SNCA και τις επακόλουθες συνουκλεϊνοπάθειες, καθώς και τη σύνδεσή τους με την πρωτεόσταση, χρησιμοποιώντας οργανοειδή μεσεγκεφάλου που προέρχονται από iPSC που φέρουν τριπλασιασμό του γονιδίου SNCA. Τα οργανοειδή με τριπλασιασμό SNCA εμφάνισαν αυξημένη συσσώρευση α-συνουκλεΐνης, εναπόθεση νευρομελανίνης, μείωση της διαμέτρου και της προβαλλόμενης περιοχής τους την 100η ημέρα. Επιπλέον, παρουσίασαν ενεργοποίηση των οδών σηματοδότησης mTORC1 (φωσφορυλιωμένη ριβοσωμική πρωτεΐνη S6; rpS6), ERK1/2, AKT και ευκαρυωτικού παράγοντα έναρξης 2 άλφα (eIF2α) κατά την 100η ημέρα. Οι πρωτεωμικές αναλύσεις εντόπισαν ανοδική ρύθμιση σε πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην αξονική, κυτταροσκελετική και συναπτική οδό ανάπτυξης και καθοδική ρύθμιση σε συστατικά της εξωκυτταρικής μήτρας (ECM), όπως η λαμινίνη. Η μελέτη του μεταγραφώματος επιβεβαίωσε αυτά τα ευρήματα δείχνοντας σημαντική καθοδική ρύθμιση στην έκφραση των αγγελιαφόρων RNA (mRNA) που σχετίζονται με την ECM και ανοδική ρύθμιση των mRNA που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που αφθονούν στα περινευρωνικά δίκτυα (PNNs). Η μαζική μεταφραστική ανάλυση ενεργά μεταφρασμένων mRNA που μετρήθηκαν με ανάλυση ριβοσωμάτων (Ribosome profiling) αποκάλυψε μέτριες αλλαγές στην ολική μετάφραση, αλλά επιλεκτική μεταφραστική ρύθμιση των νευρωνικών και των μεταγραφών που σχετίζονται με την ECM. Συνεστιακή μικροσκοπία χρησιμοποιήθηκε για να εξεταστεί η οργάνωση της ECM σε κυτταρικό επίπεδο και επιβεβαίωσε τον έντονο εμπλουτισμό της περικυτταρικής και διάμεσης δομής της ECM γύρω από τους νευρώνες σε οργανοειδή με τριπλασιασμό SNCA. Είναι ενδιαφέρον ότι αυτός ο φαινότυπος εμφανίστηκε νωρίτερα σε νευρώνες θετικούς στην τυροσινική υδροξυλάση (TH) σε σύγκριση με κύτταρα θετικά στην πρωτεΐνη 2 που σχετίζεται με μικροσωληνίσκους (MAP2). Έγινε προσπάθεια να διασαφηνιστεί εάν η αναδιαμόρφωση της ECM είναι ένας νευροπροστατευτικός ή νευροεκφυλιστικός μηχανισμός μέσω φαρμακολογικής αναστολή της ECM, ωστόσο τα αποτελέσματα ήταν ασαφή. Ντοπαμινεργικοί νευρώνες δημιουργήθηκαν και χαρακτηρίστηκαν περαιτέρω, αλλά οι νευρωνικές καλλιέργειες που προήλθαν από iPSCs με τριπλασιασμό SNCA αποδείχθηκαν μη βιώσιμες. Όλα αυτά τα ευρήματα αποκάλυψαν ότι ο τριπλασιασμός SNCA προκαλεί πρωτεοστατική διαταραχή και αναδιαμόρφωση της ECM πριν από τη νευροεκφύλιση και υποδηλώνουν ότι η αλλοιωμένη γονιδιακή έκφραση και η ομοιόσταση της ECM μπορεί να συμβάλλουν στην έναρξη και την εξέλιξη της νόσου. Η στόχευση αυτών των πρώιμων ανώμαλων μηχανισμών μπορεί να προσφέρει νέες θεραπευτικές ευκαιρίες για τις συνουκλεϊνοπάθειες, όπως η νόσος του Πάρκινσον.