Structure-function analysis of Argonaute proteins and their complexes

Abstract

Argonaute (AGO) proteins are vital for the function of most life forms. AGOs have a key role in RNA interference (RNAi), which is a fundamental mechanism of gene expression regulation. There are four human AGO proteins: AGO1, AGO2, AGO3 and AGO4. These proteins exhibit high sequence and structure similarity. Each AGO protein forms an RNA-induced silencing complex (RISC) with other proteins, some of them being Dicer and TRBP2. In humans, AGOs are guided by short non-coding RNAs, the microRNAs (miRNAs), to bind messenger RNAs (mRNAs), impacting protein synthesis. Ongoing research constantly reveals new roles either for individual AGOs or for the entire family. Moreover, AGOs are invaluable tools in diagnostics and genetic research. Nevertheless, studying human AGOs poses significant challenges for experimental investigation and there are aspects of their functions that remain to be revealed. Given these difficulties, the comparative analysis of human AGO proteins has not been sufficiently explored. Additionally, previous findings have highlighted a potential involvement of human AGOs in cell division. This work contributes to the emerging research on human AGO proteins through in silico approaches and introduces new broadly applicable methods. In the first part of the thesis, a multi-level comparative analysis of the AGO proteins is presented. The AGOs are compared at the genomic and proteomic levels. Additionally, molecular dynamics simulations of their unbound structures are performed for the first time. The trajectories are analyzed, revealing independent molecular movements for each AGO protein, despite the homology of the AGO protein family. For instance, analysis demonstrated an unsynchronized open-close conformational transition among the AGOs. Dicer, Drosha and TRBP proteins are studied, as they are important RNAi factors. The second part presents Machaon, a novel protein profiling method that seeks structural relationships between thousands of proteins and a protein of interest. These relationships are enriched with public experimental data to conduct meta-analysis at the genomic, proteomic and pathway levels. Machaon is applied to AGOs and compares them to large public protein structure datasets, including simulated AGO conformations in the search space to improve its clustering. Results support new potential functions for the AGOs, such as zinc ion binding capability. State-of-the-art deep learning models are leveraged to further enhance the hypotheses for the zinc ion binding function and the open-close conformations of the AGOs. Machaon is made available to the community via an online platform, MachaonWeb (https://machaonweb.com), which features a distributed computing network to handle user requests. The following part of the thesis is dedicated to the development of a high-performance online platform for the new version of TarBase (https://dianalab.e-ce.uth.gr/tarbasev9), an established data resource for miRNA targeting which is widely adopted by the community. Results from Machaon and TarBase for AGO proteins suggest a potential connection with mitosis. The last part focuses on the development of Platomic, a deep learning model that learns representations of atom pairs based on experimental structural data of organic molecules. A feature extraction and structural data management pipeline is implemented for generating the required training set. Preliminary results highlight a segregation of the embedding space, formed by the aggregated representations of biomolecular structures, according to structure similarity and biomolecular type.

Οι πρωτεΐνες Argonaute (AGO) είναι ζωτικής σημασίας για τη λειτουργία των περισσότερων μορφών ζωής. Οι AGOs διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στην παρεμβολή RNA (RNAi), η οποία αποτελεί έναν θεμελιώδη μηχανισμό ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης. Στον άνθρωπο υπάρχουν τέσσερις πρωτεΐνες AGO: AGO1, AGO2, AGO3 και AGO4. Αυτές οι πρωτεΐνες παρουσιάζουν υψηλή ομοιότητα αλληλουχίας και δομής. Κάθε πρωτεΐνη AGO σχηματίζει ένα σύμπλοκο σίγασης RNA (RNA-induced silencing complex, RISC) με άλλες πρωτεΐνες, μεταξύ των οποίων οι Dicer και TRBP2). Οι AGO καθοδηγούνται από μικρά μη κωδικοποιητικά RNAs, τα miRNAs, ώστε να προσδέσουν σε αγγελιοφόρα RNA (mRNAs), επηρεάζοντας την σύνθεση των πρωτεϊνών. Πέρα από αυτόν τον θεμελιώδη μηχανισμό, η βασική έρευνα εξακολουθεί να αποκαλύπτει διαρκώς νέους ρόλους, είτε για μεμονωμένες AGO, είτε για ολόκληρη την οικογένεια. Επίσης, οι AGO αποτελούν ανεκτίμητα εργαλεία στη διάγνωση και τη γενετική έρευνα Παρ’ όλα αυτά, η μελέτη των ανθρώπινων AGOs παρουσιάζει σημαντικές προκλήσεις για την πειραματική διερεύνηση και υπάρχουν πτυχές των λειτουργιών τους που παραμένουν άγνωστες. Δεδομένων αυτών των δυσκολιών, η συγκριτική ανάλυση των ανθρώπινων πρωτεϊνών AGO δεν είχε πραγματοποιηθεί επαρκώς πριν από αυτή την εργασία. Επιπλέον, προηγούμενα ευρήματα έχουν υποδείξει μια πιθανή εμπλοκή των ανθρώπινων AGOs στη κυτταρική διαίρεση, η οποία διερευνάται περαιτέρω στην παρούσα μελέτη. Η παρούσα εργασία συμβάλλει στη μελέτη των πρωτεϊνών AGO μέσω υπολογιστικών (in silico) προσεγγίσεων και εισάγει νέες, ευρέως εφαρμόσιμες μεθόδους. Στο πρώτο μέρος της διατριβής παρουσιάζεται μια πολυεπίπεδη συγκριτική ανάλυση των πρωτεϊνών AGO. Οι πρωτεΐνες AGO συγκρίνονται σε γονιδιωματικό και πρωτεωμικό επίπεδο. Επίσης, πραγματοποιούνται για πρώτη φορά προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής των ελεύθερων δομών τους. Η ανάλυση των προσομοιώσεων αποκαλύπτει ανεξάρτητες μοριακές κινήσεις για κάθε πρωτεΐνη AGO, παρά την υψηλή ομολογία της οικογένειας. Για παράδειγμα, η ανάλυση ανέδειξε μια ασύγχρονη μεταβολή ανοικτής-κλειστής διαμόρφωσης των AGOs. Μελετώνται επίσης οι πρωτεΐνες Dicer, Drosha και TRBP, καθώς αποτελούν σημαντικούς παράγοντες του μηχανισμού RNAi. Το δεύτερο μέρος παρουσιάζει το Machaon, μια νέα μέθοδο που αναζητά δομικές σχέσεις μεταξύ χιλιάδων πρωτεϊνών και μιας πρωτεΐνης ενδιαφέροντος. Αυτές οι σχέσεις εμπλουτίζονται με πειραματικά δεδομένα ανοικτής πρόσβασης για τη διεξαγωγή μετα-ανάλυσης σε επίπεδο γονιδιωματικό, πρωτεομικό και βιολογικών οδών. Το Machaon εφαρμόζεται στις AGOs και τις συγκρίνει με μεγάλα σύνολα δεδομένων πρωτεϊνικών δομών ανοικτής πρόσβασης, ενσωματώνοντας προσομοιωμένες εναλλακτικές αναδιπλώσεις των AGOs στον χώρο αναζήτησης για τη βελτίωση της συσταδοποίησης του. Τα αποτελέσματα υποστηρίζουν νέες πιθανές λειτουργίες για τις AGOs, όπως η ικανότητα δέσμευσης ιόντων ψευδαργύρου. Χρησιμοποιούνται προηγμένα μοντέλα βαθιάς μάθησης για την περαιτέρω ενίσχυση των υποθέσεων σχετικά με τη δέσμευση ιόντων ψευδαργύρου και τις ανοικτές-κλειστές διαμορφώσεις των AGOs. Το Machaon διατίθεται στην επιστημονική κοινότητα μέσω της διαδικτυακής πλατφόρμας MachaonWeb (https://machaonweb.com), η οποία διαθέτει ένα κατανεμημένο υπολογιστικό δίκτυο για την εξυπηρέτηση των αιτημάτων των χρηστών. Το επόμενο τμήμα της διατριβής περιλαμβάνει την ανάπτυξη μιας διαδικτυακής πλατφόρμας υψηλής απόδοσης για τη νέα έκδοση του TarBase (https://dianalab.e-ce.uth.gr/tarbasev9), ενός καθιερωμένου πόρου δεδομένων για την στόχευση των miRNAs, ο οποίος έχει υιοθετηθεί ευρέως από την επιστημονική κοινότητα. Το τελευταίο μέρος εστιάζει στην ανάπτυξη του Platomic, ενός μοντέλου βαθιάς μάθησης που μαθαίνει αναπαραστάσεις ζευγών ατόμων βασισμένο σε πειραματικά δομικά δεδομένα οργανικών μορίων. Υλοποιείται πρόγραμμα διαχείρισης δομικών δεδομένων και εξαγωγής χαρακτηριστικών για τη δημιουργία του απαιτούμενου συνόλου δεδομένων εκπαίδευσης. Παρουσιάζονται επίσης αρχικά αποτελέσματα, τα οποία αναδεικνύουν έναν διαχωρισμό του χώρου αναπαραστάσεων, που διαμορφώνεται από τις συσσωρευμένες αναπαραστάσεις βιομοριακών δομών, ανάλογα με τη δομική ομοιότητα και τον τύπο του βιομορίου.