Βελτίωση μεθόδων σύνθεσης πεπτιδίων και πρωτεϊνών σε στερεά φάση και εφαρμογή τους στη σύνθεση προστατευμένων πεπτιδικών τμημάτων της HIV-1 πρωτεάσης

Abstract

The chemical synthesis of large peptides and proteins remains demanding, mainly due to incomplete couplings, racemization and the low solubility of protected fragments, particularly when “difficult” sequences are involved that tend to form secondary structures. This doctoral dissertation describes the development and improvement of methodologies for peptide and protein synthesis in solid phase (SPPS), with emphasis on 2-chlorotrityl resin (CLTR) and trityl-type resins, and with the aim of applying them to the synthesis of protected peptide fragments of HIV-1 protease. The work includes the synthesis and purification of selected protected fragments of HIV-1 protease on 2-chlorotrityl resin (CLTR), as well as the development of strategies that combine solid- and solution-phase steps. In particular, a “phase-change strategy” was investigated, in which protected fragments are temporarily cleaved from the resin, subjected to fragment condensation in solution, and re-esterified onto a solid support for continuation of the synthesis. In parallel, methods for side-chain anchoring via His and Cys residues on trityl-type resins were studied, and cysteinyl and cysteamine-based supports were developed, in which cysteine and cysteamine function as flexible linkers between the trityl core and the target compound under synthesis. Products of this type can serve as an important tool in the development of solid-phase synthesis strategies, as well as peptide structures that exploit the properties of sulfur.The results show that the proposed methodologies contribute substantially to overcoming the limitations of classical solid-phase synthesis and fragment condensation, particularly in “difficult” sequences such as those of HIV-1 protease. This flexible framework, which combines optimized protecting-group orthogonal strategies, a phase-change strategy and side-chain anchoring on trityl-type resins and cysteamine-based supports, opens up prospects for the efficient synthesis of complex peptides, small proteins and libraries of compounds with pharmaceutical interest.

Η χημική σύνθεση μεγάλων πεπτιδίων και πρωτεϊνών παραμένει απαιτητική, κυρίως λόγω ατελών συζεύξεων, ρακεμίωσης και χαμηλής διαλυτότητας των προστατευμένων τμημάτων, ιδίως όταν περιλαμβάνονται «δύσκολες» αλληλουχίες με τάση σχηματισμού δευτεροταγών δομών. Η παρούσα διδακτορική διατριβή περιγράφει την ανάπτυξη και βελτίωση μεθοδολογιών σύνθεσης πεπτιδίων και πρωτεϊνών σε στερεά φάση (SPPS), με χρήση της 2-χλωροτριτυλο-ρητίνης (CLTR) και άλλων τριτυλ-τύπου ρητινών, και με στόχο την εφαρμογή τους στη σύνθεση προστατευμένων πεπτιδικών τμημάτων της HIV-1 πρωτεάσης. Η εργασία περιλαμβάνει τη σύνθεση και τον καθαρισμό επιλεγμένων προστατευμένων τμημάτων της HIV-1 πρωτεάσης επί της CLTR, καθώς και την ανάπτυξη στρατηγικών που συνδυάζουν τη στερεά με την υγρή φάση. Ειδικότερα, μελετήθηκε μία στρατηγική «αλλαγής φάσης», κατά την οποία προστατευμένα τμήματα αποδεσμεύονται προσωρινά από τη ρητίνη, υποβάλλονται σε σύζευξη σε διάλυμα και επανεστεροποιούνται σε στερεό υπόστρωμα για συνέχιση της σύνθεσης. Παράλληλα, διερευνήθηκαν μέθοδοι πλευρικής αγκύρωσης μέσω καταλοίπων ιστιδίνης (His) και κυστεΐνης (Cys) σε τριτυλ-τύπου ρητίνες και αναπτύχθηκαν κυστεϊνο- και κυστεαμινο-φορείς, στους οποίους η κυστεΐνη και η κυστεαμίνη μπορεί να λειτουργήσουν ως ευέλικτοι συνδετικοί βραχίονες (linkers) μεταξύ του τριτυλικού πυρήνα και της υπό σύνθεσης ένωσης. Τέτοιου τύπου προϊόντα μπορεί να αποτελέσουν σημαντικό εργαλείο στην ανάπτυξη στρατηγικών σύνθεσης σε στερεή φάση, καθώς και πεπτιδικών δομών, οι οποίες εκμεταλλεύονται τις ιδιότητες του θείου. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι προτεινόμενες μεθοδολογίες συμβάλλουν ουσιαστικά στην υπέρβαση των περιορισμών της κλασικής σύνθεσης σε στερεά φάση και της συμπύκνωσης προστατευμένων τμημάτων, ιδίως σε «δύσκολες» αλληλουχίες, όπως αυτές της HIV-1 πρωτεάσης. Το ευέλικτο αυτό πλαίσιο, το οποίο συνδυάζει βελτιστοποιημένες στρατηγικές ορθογωνικής προστασίας, στρατηγική αλλαγής φάσης και πλευρική διασύνδεση σε τριτυλ-τύπου ρητίνες και κυστεαμινο-φορείς, ανοίγει προοπτικές για την αποδοτική σύνθεση σύνθετων πεπτιδίων, μικρών πρωτεϊνών και βιβλιοθηκών ενώσεων με φαρμακευτικό ενδιαφέρον.