Επιδράσεις της διαφοροποίησης της λειτουργίας του μασητήρα στην κροταφογναθική διάρθρωση και την κάτω γνάθο επίμυων: απεικονιστική, ιστολογική και μορφομετρική μελέτη

Abstract

Introduction: Investigating the role of masticatory muscles in mandibular growth and overall craniofacial development is highly significant, given the fundamental link between muscular activity and bone development. Nonetheless, the interplay between unilateral superficial masseter muscle resection and modifications in dietary composition has yet to be thoroughly examined in animal models. Objective: This study aimed to compare histological, imaging, and morphometric changes οn mandibular growth in growing rats subjected to unilateral masseter muscle resection. Additionally, the investigation examined the effects of a soft food diet versus a hard food diet to assess diet’s consistency impact on mandibular growth. The research questions addressed are as follows: a)What is the effect of unilateral superficial masseter muscle resection on craniofacial morphology in growing rats, compared to healthy control animals? b)What is the impact of varying dietary consistency on craniofacial morphology in growing rats that have undergone unilateral masseter muscle resection? Materials and Methods: The experimental protocol was approved by the Veterinary Directorate of the Attica Region under Protocol No. 776836/9-08-2022 and Registration Code EL 25 BIO exp 05, in compliance with the Greek National Legislation (Presidential Decree 56/2013) as well as the EU Directive 2010/63/EU of the European Parliament and Council (276/33/20.10.2010) regarding the protection of animals used for scientific purposes. Experimental Design: Forty-eight male Wistar rats, aged six weeks, participated in the study. All animals were housed at the Experimental Surgery and Surgical Research Laboratory "N.S. Christeas" of the Dental School at the University of Athens. In accordance with Νational and European legislation, the animals were maintained in an environment with a stable airflow (15 air changes per hour), a temperature of 20–22°C, and relative humidity between 55% and 66%. The rats were housed in open-top cages (Tecniplast S.P.A., Italy) and provided with ad libitum access to food and water. The animals were randomly assigned to four groups. •In experimental group A, unilateral resection of the left superficial part of the masseter muscle was performed, and the animals were fed a standard (hard) diet. •In experimental group B, unilateral resection of the left superficial part was also performed, but the animals were fed a soft diet. •In the control groups, group C animals remained unoperated and were fed a hard diet, while group D animals remained unoperated and were fed a soft diet.On the first day of the experiment, all groups underwent cone beam computed tomography (CBCT) scanning of the head, followed by unilateral resection of the masseter muscle on the left side for the relevant experimental groups. On the 31st day of the experiment, all rats underwent a CBCT scan, after which they were euthanized. Subsequently, the heads were separated from the bodies and the mandibles were prepared for histological analysis. Three-Dimensional Imaging Analysis: For the evaluation of the three-dimensional morphology of the mandible, each animal underwent CBCT scans at two time points: on the first day of the experiment and on the day of sacrifice. Initially, the rats were anesthetized via intramuscular injection of a combination of ketamine and xylazine at a dosage of 0.2 mg/kg. Thereafter, all animals were scanned using the same CBCT unit (New Tom VGi, Cefla SC, Imola, Italy), with an 8×8 cm high-resolution field of view and an exposure setting of 110 kV. Scans were performed by a maxillofacial radiologist, and repeated if necessary. Finally, linear measurements and further three-dimensional data analysis were conducted using Viewbox software (version 4.1.3.1, dHAL Software, Kifisia, Greece). Histological Preparation: On the 31st day of the experiment, the rats were euthanized. The specimens were fixed in a 10% formalin solution. Thereafter, the left condyle, from which the masseter muscle had been unilaterally resected, was processed. The same for the control groups. Tissue sections were stained with hematoxylin and eosin to evaluate potential histomorphometric changes in both the condylar bone and the cartilage surface. Statistical Analysis: Subgroups consisting of 12 rats were defined based on standard statistical criteria (α = 0.05, β = 0.10), ensuring 90% power to detect a 0.5 mm difference (26.5 vs. 27.0 mm, SD 0.37) in the primary outcome measure, i.e., mandibular length. In total, 48 male Wistar rats, aged six weeks, were randomly assigned to experimental and control groups. Differences related to group and diet were evaluated using linear regression models, either through analysis of variance (ANOVA) or the Kruskal-Wallis test. Data were coded and analyzed using SPSS vr 21.00 (IBM Corporation, Somers, NY, USA). Results: Three-dimensional imaging analysis revealed significant differences in the anteroposterior dimensions between experimental and control subgroups. A significant difference in mandibular length and ramus height was observed on the experimental side of the experimental group (p < 0.005), where the masseter muscle resection was performed. Regardless of diet (hard or soft food), the experimental group exhibited a restriction in both total mandibular length and mandibular body length compared to the control group (p < 0.005). Histological analysis revealed significant histomorphometric differences in the mandibular condyle where masseter muscle resection was performed. In particular, the Bone Volume / Total Volume ratio was found to be diminished in both the mesial and distal condylar regions. Additionally, a significant reduction in anterior condylar cartilage thickness was observed at the condyle where unilateral masseter muscle resection was performed. Conclusion: Mandibular growth in growing rats subjected to unilateral masseter muscle resection resulted in significant asymmetry in mandibular development during adulthood. Notably, dietary composition (soft versus hard) did not exert a statistically significant influence on the outcomes. Histological examination further revealed alterations in the architecture of the condylar bone and cartilage surface. These findings underscore the critical role of masticatory function in craniofacial development and demonstrated that muscle resection, rather than dietary modification, is the primary determinant of altered mandibular growth. Better understanding the bone growth mechanisms may contribute to the development of therapeutic protocols for patients with muscular dystrophy, muscle atonia, or asymmetry.

Εισαγωγή: Η μελέτη της συμβολής των μασητήριων μυών στη λειτουργία και στην αύξηση της κάτω γνάθου είναι ιδιαίτερα σημαντική, δεδομένου ότι η οστική αύξηση είναι αρρηκτά συνδεδεμένη με τη μυϊκή λειτουργία. Ωστόσο, μέχρι σήμερα δεν έχει διερευνηθεί επαρκώς η επίδραση της ετερόπλευρης εκτομής της επιπολής μοίρας του μασητήρα μυ και της διαφοροποίησης της διατροφικής σύστασης σε πειραματόζωα. Σκοπός: Ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να διερευνηθεί, μέσω ιστολογικών, απεικονιστικών και μορφομετρικών μεθόδων ανάλυσης, η επίδραση της χορήγησης μαλακής και σκληρής τροφής σε επίμυες που έχουν υποστεί ετερόπλευρη εκτομή της επιπολής μοίρας του μασητήρα μυ. Στόχος είναι, αφ’ ενός, να αξιολογηθεί ο βαθμός συμβολής της λειτουργίας του μασητήρα στην αύξηση της κάτω γνάθου και, αφ’ ετέρου, να εξεταστεί η επίδραση της διαφορετικής διατροφικής σύστασης στη μείωση της μυϊκής λειτουργίας. Στόχος της μελέτης: Ο στόχος της παρούσας μελέτης είναι η παρουσίαση σύγχρονων δεδομένων που διερευνούν τη συμβολή των μασητήρων στην αύξηση της κάτω γνάθου. Τα ερευνητικά ερωτήματα που θα απαντηθούν είναι τα εξής: Ποια είναι η επίδραση της σκληρής διατροφής στην γναθοπροσωπική μορφολογία σε αναπτυσσόμενους επίμυες που έχουν υποστεί ετερόπλευρη εκτομή της επιπολής μοίρας του μασητήρα; Ποια είναι η επίδραση της μαλακής διατροφής στην γναθοπροσωπική μορφολογία σε αναπτυσσόμενους επίμυες που έχουν υποστεί ετερόπλευρη εκτομή της επιπολής μοίρας του μασητήρα; Ποια είναι η επίδραση της ετερόπλευρης εκτομής της επιπολής μοίρας του μασητήρα στην γναθοπροσωπική μορφολογία σε αναπτυσσόμενους επίμυες, σε σύγκριση με επίμυες που αναπτύσσονται χωρίς εκτομή (ομάδα ελέγχου); Υλικά και Μέθοδος: Το πειραματικό πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από τη Διεύθυνση Κτηνιατρικής της Περιφέρειας Αττικής, με αριθμό πρωτοκόλλου 776836/9-08-2022 και κωδικό καταχώρησης EL 25 ΒΙΟ 05. Η έγκριση τηρούσε τις απαιτήσεις της Ελληνικής Εθνικής νομοθεσίας (ΠΔ 56/2013) καθώς και της Οδηγίες 2010/63/ΕΕ του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου (276/33/20.10.2010) για την προστασία των ζώων που χρησιμοποιούνται για επιστημονικούς σκοπούς. Σχεδιασμός Πειράματος: Στην παρούσα πειραματική μελέτη συμμετείχαν 48 αρσενικοί επίμυες Wistar ηλικίας έξι εβδομάδων. Όλα τα ζώα στεγάστηκαν στο Εργαστήριο Πειραματικής Χειρουργικής και Χειρουργικής Έρευνας «Ν.Σ. Χρηστέας» της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Αθηνών. Σύμφωνα με την εθνική και ευρωπαϊκή νομοθεσία, τα ζώα διατηρήθηκαν σε περιβάλλον με σταθερό αερισμό (15 αλλαγές αέρα/ώρα), θερμοκρασία 20-22°C και σχετική υγρασία 55-66%. Οι επίμυες τοποθετήθηκαν σε κλουβιά ανοιχτής βάσης (Tecniplast S.P.A., Ιταλία) ανά ομάδα, ενώ η πρόσβαση σε τροφή και νερό ήταν ελεύθερη. Τα ζώα κατανεμήθηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες. Στην πειραματική ομάδα Α πραγματοποιήθηκε ετερόπλευρη εκτομή της επιπολής μοίρας του μασητήρα και τα ζώα διατρέφονταν με φυσιολογική τροφή (σκληρή τροφή). Στην ομάδα Β επίσης πραγματοποιήθηκε ετερόπλευρη εκτομή της επιπολής μοίρας του μασητήρα, αλλά τα ζώα διατρέφονταν με μαλακή τροφή. Ως ομάδες ελέγχου, στην ομάδα Γ τα ζώα παρέμεναν φυσιολογικά και διατρέφονταν με σκληρή τροφή, ενώ στην ομάδα Δ τα ζώα ήταν φυσιολογικά και διατρέφονταν με μαλακή τροφή. Την πρώτη πειραματική ημέρα όλες οι ομάδες υπέστησαν έκθεση της κεφαλής σε Υπολογιστικό τομογράφο κωνικής δέσμης (CBCT) και έπειτα αφαιρέθηκε η επιπολής μοίρα των μασητήρων ετερόπλευρα αριστερά στα ζώα που συμμετείχαν στις αντίστοιχες ομάδες . Την τριακοστή πρώτη ημέρα του πειράματος, σε όλους τους επίμυες των τεσσάρων ομάδων, πραγματοποιήθηκε CBCT, ακολουθούμενο από ευθανασία. Στη συνέχεια, διαχωρίστηκαν τα κεφάλια από το σώμα και προετοιμάστηκε η κάτω γνάθος για ιστολογική ανάλυση.Τρισδιάστατη απεικονιστική ανάλυση: Για την αξιολόγηση της τρισδιάστατης μορφολογίας της κάτω γνάθου, σε κάθε πειραματόζωο πραγματοποιήθηκαν υπολογιστικές τομογραφίες κωνικής δέσμης (CBCT) σε δύο χρονικές στιγμές: την πρώτη ημέρα του πειράματος και την ημέρα θυσίας. Αρχικά, οι επίμυες έλαβαν αναισθησία μέσω ενδομυϊκής ένεσης ενός συνδυασμού κεταμίνης και ξυλαζίνης σε δοσολογία 0,2 mg/kg. Στη συνέχεια, όλα τα ζώα σαρώθηκαν με την ίδια μονάδα CBCT (New Tom VGi, Cefla SC, Imola, Ιταλία), χρησιμοποιώντας ένα οπτικό πεδίο 8×8 cm υψηλής ανάλυσης και ρυθμίσεις έκθεσης στα 110 kV. Τέλος, για την εκτέλεση γραμμικών μετρήσεων και την περαιτέρω τρισδιάστατη απεικονιστική ανάλυση των δεδομένων, χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό Viewbox (έκδοση 4.1.3.1, dHAL Software, Κηφισιά, Ελλάδα). Ιστολογική Προετοιμασία: Την τριακοστή πρώτη ημέρα του πειράματος, οι επίμυες θυσιάστηκαν. Τα παρασκευάσματα διατηρήθηκαν σε διάλυμα φορμόλης 10%. Στη συνέχεια, απομονώθηκαν και επεξεργάστηκαν ο αριστερός κονδύλος, όπου πραγματοποιήθηκε ετερόπλευρη εκτομή της επιπολής μοίρας του μασητήρα, καθώς και ο δεξιός κονδύλος της ίδιας πειραματικής ομάδας. Αντίστοιχα, στις ομάδες ελέγχου απομονώθηκε μόνο ο αριστερός κονδύλος. Οι τομές χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (ΗΕ) για να αξιολογηθούν πιθανές ιστομορφολογικές αλλαγές τόσο στο οστό του κονδύλου όσο και στην χόνδρινη επιφάνεια. Στατιστική επεξεργασία: Οι υποομάδες, αποτελούμενες από 12 επίμυες, ορίστηκαν βάσει τυπικών στατιστικών κριτηρίων (α = 0,05, β = 0,10), εξασφαλίζοντας ισχύ 90% για την ανίχνευση διαφοράς 0,5 mm (26,5 εναντίον 27,0 mm, SD 0,37) ως κύριο αποτέλεσμα της μελέτης, δηλαδή το μήκος της κάτω γνάθου. Συνολικά, χρησιμοποιήθηκαν 48 αρσενικοί επίμυες Wistar ηλικίας έξι εβδομάδων τυχαία κατανεμημένοι σε πειραματική ομάδα και ομάδα ελέγχου. Οι διαφορές στις μετρήσεις που σχετίζονταν με την ομάδα και τον χρόνο αξιολογήθηκαν με τη χρήση γραμμικών μοντέλων παλινδρόμησης, είτε μέσω ανάλυσης διακύμανσης (ANOVA) είτε με το τεστ Kruskal-Wallis. Τα δεδομένα κωδικοποιήθηκαν και αναλύθηκαν με το στατιστικό λογισμικό Stata (Stata Statistical Software, Stata Corp LP). Αποτελέσματα: Από την τρισδιάστατη απεικονιστική ανάλυση, οι μετρήσεις κατέδειξαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των πειραματικών ομάδων. Συγκεκριμένα διαπιστώθηκε αξιοσημείωτη διαφοροποίηση στο κατακόρυφο ύψος του κλάδου της κάτω γνάθου της πλευράς όπου πραγματοποιήθηκε η εκτομή του μασητήρα μυός σε σύγκριση με την πλευρά που έμεινε ανέπαφη. Ανεξαρτήτως της σύστασης της τροφής (σκληρή ή μαλακή), η πειραματική ομάδα εμφάνισε περιορισμό τόσο στο συνολικό μήκος της κάτω γνάθου όσο και στο μήκος του σώματός της, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (p < 0,005). Παράλληλα, η ιστολογική ανάλυση αποκάλυψε σημαντικές ιστομορφομετρικές διαφορές στον κόνδυλο της κάτω γνάθου όπου πραγματοποιήθηκε η εκτομή του μασητήρα μυός. Συγκεκριμένα, η αναλογία της οστικής επιφάνειας προς τη συνολική επιφάνεια (Bone Surface/Total Surface) βρέθηκε μειωμένη τόσο στην πρόσθια όσο και στην οπίσθια περιοχή του κονδύλου. Επιπλέον, παρατηρήθηκε σημαντική μείωση στο πάχος του οπίσθιου χόνδρου του κονδύλου, στο σημείο όπου πραγματοποιήθηκε μονομερός εκτομή του μασητήρα μυός. Συμπεράσματα: Η ανάπτυξη της γνάθου στους αναπτυσσόμενους επίμυες που υπέστησαν ετερόπλευρη εκτομή του μασητήρα είχε ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη ασύμμετρης κάτω γνάθου κατά την ενηλικίωση. Η τροφή δεν έδειξε στατιστικά σημαντική επίδραση. Ιστολογικά, παρατηρήθηκαν αλλαγές στην αρχιτεκτονική του οστού του κονδύλου και στη χονδρική επιφάνεια του. Η πειραματική μας μελέτη επέτρεψε την παρατήρηση οστικών μεταβολών στην κάτω γνάθο, οι οποίες προέκυψαν μετά από παρέμβαση στη λειτουργία της μάσησης, εξαιτίας της εκτομής της επιπολής μοίρας του μασητήρα και της διαφοροποίησης της σύστασης της διατροφής.