Προσδιορισμός και μελέτη των μετα-μεταγραφικών τροποποιήσεων Ν6-μεθυλαδενοσίνη και 5-μεθυλοκυτοσίνη των ανθρώπινων mRNAs στον καρκίνο του μαστού

Abstract

The study of post-transcriptional RNA modifications constitutes a rapidly expanding frontier in molecular biology, unveiling additional layers of gene expression and regulation beyond DNA sequence and epigenetic mechanisms. Among more than 170 different modifications that have been described, N6-methyladenosine (m6A) and 5-methylcytosine (m5C) stand out as the most abundant and well-studied. These modifications play a central role in mRNA metabolism by influencing transcript stability, modulating translational efficiency, and controlling degradation rates, thereby shaping cellular functions and contributing to disease phenotypes. Three distinct groups of enzymes have been identified in the regulation of RNA modifications: writers, which catalyze the deposition of modifications; erasers, which remove them; and readers, which recognize and interpret them. The functional characterization of these enzyme classes, together with insights into the biological roles of the modifications themselves, has firmly established the epitranscriptome as a dynamic and reversible layer of gene expression regulation that can rapidly adapt to cellular signals and pathways. The detection of RNA modifications has traditionally relied on antibody-based immunoprecipitation approaches, including m6A-seq, MeRIP-seq, and miCLIP, which enabled transcriptome-wide mapping of methylated regions but suffer from limited nucleotide resolution, antibody cross-reactivity, and difficulties in accurately quantifying methylation stoichiometry. On the contrary, chemical-based methods, such as RNA bisulfite sequencing (RBS-seq), provided single-nucleotide resolution maps of 5-methylcytosine (m5C) but were hampered by partial RNA degradation, incomplete conversion, and limited specificity in distinguishing closely related modifications. Additional techniques, including Aza-IP, PA-m6A-seq, and MazF-based cleavage assays, have been employed to improve detection sensitivity and resolution, yet these approaches remain labor-intensive and prone to technical artifacts. In recent years, the advent of third-generation sequencing, particularly direct RNA sequencing using nanopores (Oxford Nanopore Technologies, ONT), has revolutionized the field. This platform directly records the ionic current disruptions generated as modified nucleotides pass through the nanopore, thereby capturing the intrinsic ‘electrical signatures’ of modifications without the need for chemical treatment, reverse transcription, or amplification. Such an approach enables the simultaneous acquisition of both primary sequence and epitranscriptomic information at single-molecule resolution, facilitating the identification of RNA modifications and their dynamic distribution across diverse transcriptomes. Notably, these advances have transformed epitranscriptomic profiling from indirect, antibody- and chemical-assisted methods into a direct, high-resolution, and quantitative framework for studying the functional role of RNA modifications. Breast cancer is the most frequently diagnosed malignancy in women worldwide and represents a major cause of cancer-related mortality. A hallmark of the disease is its pronounced heterogeneity at both molecular and clinical levels, which is reflected in the classification of distinct subtypes, including luminal A, luminal B, HER2-positive, and triple-negative breast cancer (TNBC). These subtypes differ markedly in their molecular signatures, clinical progression, and therapeutic responses. Emerging evidence indicates that RNA modifications—particularly N6-methyladenosine (m6A) and 5-methylcytosine (m5C)—play pivotal roles in breast cancer biology by influencing key processes such as cell proliferation, invasion, metastasis, and resistance to therapy. While the enzymatic machinery responsible for installing, removing, and interpreting these modifications has been extensively studied, the precise transcriptome-wide distribution, dynamics, and functional consequences of m6A and m5C in human breast cancer remain insufficiently characterized. A deeper understanding of these RNA modifications in the context of breast cancer holds promise for identifying novel biomarkers, uncovering mechanisms underlying disease heterogeneity, and developing innovative therapeutic strategies tailored to specific molecular subtypes.In the present thesis, a comprehensive and systematic study of m6A and m5C modifications in breast cancer cell lines was conducted, leveraging nanopore sequencing technology combined with bioinformatics analysis. Five breast cancer cell lines representing major molecular subtypes (MCF-7, BT-474, BT-20, MDA-MB-231, and SK-BR-3), as well as the non-cancerous MCF-10A cell line as a normal control, were used. Bioinformatics analysis revealed thousands of potential m6A and m5C sites, of which approximately 1–2% were classified as “high-confidence” sites based on stringent criteria, minimizing false positives. A strong preference of m6A for the conserved 5'-DRACH-3' motif, which is recognized by the METTL3/14 methyltransferase complex, was confirmed, while m5C was found in more complex motifs, with a notable enrichment at the 5'-CNGGG-3' motif, characteristic of NSUN2. Both modifications appeared across all mRNA regions, with a preference for 3' UTRs, particularly near stop codons. Differential methylation analysis between cancerous and non-cancerous cells revealed primarily increased methylation levels in the cancerous cell lines. Comparative analysis among breast cancer molecular subtypes revealed both shared and subtype-specific methylation sites, reflecting the molecular heterogeneity of the disease. In addition, the role of two key enzymes, the demethylase ALKBH5 and the methyltransferase NSUN2, were investigated through gene editing using the CRISPR/Cas9 system. This intervention led to significant changes in the corresponding modification levels, confirming their crucial role in the regulation of the epitranscriptome. Specifically, the loss of ALKBH5 was associated with increased m6A levels at certain 5'-DRACH-3' motifs, suggesting selectivity in its activity and potential involvement of additional enzymes in m6A removal. Similarly, knockout of the NSUN2 gene led to reduced m5C levels at its target motifs, while the detection of novel methylation sites in previously uncharacterized regions supports the idea that other methyltransferases may also regulate m5C modifications in human mRNAs. One of the most significant achievements of the present doctoral dissertation was the design, construction, and functional evaluation of an innovative molecular tool that combines the catalytically inactive form of the RfxCas13d protein (dRfxCas13d) with the human RNA demethylase ALKBH5, enabling the targeted demethylation of specific m6A sites in human mRNAs. The plasmid vector Dem6A-Vec, developed in the context of this study, incorporates all the necessary components for the co-expression of the dRfxCas13d–ALKBH5 complex and the corresponding gRNA, providing a unified, “all-in-one” system with high efficiency and specificity. The implementation of the system in human cells demonstrated its ability to induce precise and selective demethylation at specific m6A sites without off-target effects. Experimental results confirmed that the removal of m6A from selected mRNAs can affect their stability and, consequently, modulate gene expression with high accuracy and specificity. Furthermore, analysis of methylation dynamics revealed that the demethylation achieved by the system is transient and reversible, reflecting the inherent plasticity of the epitranscriptome. This transience depends on the half-life of the mRNAs, the synthesis of new transcripts, and the presence and expression of the plasmid within the cells. The ability to achieve targeted, non-permanent, and tunable modulation of m6A methylation levels at single-nucleotide resolution provides a powerful framework for investigating the functional consequences of post-transcriptional modifications. Overall, the in-house developed Dem6A-Vec system constitutes a robust, scalable and versatile tool for precise RNA editing and the functional dissection of individual m6A sites, providing novel insights into the plasticity and reversibility of RNA modifications, and offering a powerful methodological advance with direct implications for cancer biology and the development of future therapeutic strategies. In summary, the present thesis demonstrates that the implementation of third-generation sequencing technology, advanced bioinformatics analysis, and innovative molecular approaches—such as the in-house developed targeted m6A demethylation system—provides a reliable and comprehensive mapping of m6A and m5C modifications in breast cancer. Ultimately, the present doctoral thesis not only contributes new knowledge on breast cancer pathogenesis and heterogeneity but also paves the way for exploiting epitranscriptomic modifications as potential biomarkers and/or therapeutic targets in the context of personalized medicine.

Η μελέτη των μετα-μεταγραφικών τροποποιήσεων του RNA αποτελεί ένα από τα πλέον δυναμικά και ταχέως αναπτυσσόμενα πεδία της Μοριακής Βιολογίας, αποκαλύπτοντας νέα επίπεδα ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης πέραν του DNA και των παραδοσιακών επιγενετικών μηχανισμών. Ανάμεσα σε περισσότερες από 170 διαφορετικές τροποποιήσεις που έχουν περιγραφεί, η Ν6-μεθυλαδενοσίνη (m6A) και η 5-μεθυλοκυτοσίνη (m5C) ξεχωρίζουν ως οι πιο άφθονες και καλύτερα μελετημένες. Οι συγκεκριμένες τροποποιήσεις παίζουν κεντρικό ρόλο στη σταθερότητα των mRNAs, στη ρύθμιση της μεταφραστικής τους ικανότητας αλλά και στον ρυθμό αποικοδόμησής τους, επηρεάζοντας έτσι άμεσα την κυτταρική λειτουργία. Η ανακάλυψη εξειδικευμένων ενζύμων που ενσωματώνουν (writers), απομακρύνουν (erasers) ή αναγνωρίζουν (readers) τις τροποποιήσεις αυτές ανέδειξε ότι το επιμεταγράφωμα είναι ένας δυναμικός και αναστρέψιμος μηχανισμός ελέγχου της γονιδιακής έκφρασης, ο οποίος μπορεί να μεταβάλλεται γρήγορα ανάλογα με τα ερεθίσματα και τις ανάγκες του κυττάρου. Παραδοσιακά, η ανίχνευση των μετα-μεταγραφικών τροποποιήσεων στηρίχθηκε σε τεχνικές που βασίζονται στη χρήση αντισωμάτων, όπως για παράδειγμα οι μεθοδολογίες m6A-seq, MeRIP-seq και miCLIP, οι οποίες όμως εμφανίζουν περιορισμούς όσον αφορά την ανάλυση σε επίπεδο νουκλεοτιδίου και την ποσοτικοποίηση των θέσεων μεθυλίωσης. Παράλληλα, η ανάπτυξη χημικών μεθόδων, όπως το RBS-seq, επέτρεψε τον προσδιορισμό των θέσεων m5C σε επίπεδο νουκλεοτιδίου, αν και με μειονεκτήματα όπως ο κατακερματισμός του RNA και η χαμηλή ειδικότητα για τη διάκριση συγγενών τροποποιήσεων. Τα τελευταία χρόνια, η τεχνολογία άμεσης αλληλούχησης του RNA μέσω νανοπόρων (Oxford Nanopore Technologies, ONT) αποτελεί μια νέα καινοτομία για τη μελέτη του μεταγραφώματος. Η δυνατότητα καταγραφής των ιοντικών σημάτων που φέρουν τις «υπογραφές» των τροποποιημένων νουκλεοτιδίων, χωρίς να απαιτείται προ-επεξεργασία του δείγματος, κατέστησε εφικτή την ταυτόχρονη χαρτογράφηση της αλληλουχίας και των μετα-μεταγραφικών τροποποιήσεων με αυξημένη ακρίβεια. Η καινοτομία αυτή ανοίγει νέους ορίζοντες στην επιμεταγραφωμική, καθιστώντας δυνατή την ανακάλυψη νέων ρυθμιστικών μηχανισμών που έως τώρα παρέμεναν άγνωστοι. Ο καρκίνος του μαστού αποτελεί την πιο συχνή κακοήθεια στις γυναίκες και χαρακτηρίζεται από μεγάλη ετερογένεια τόσο σε μοριακό όσο και σε κλινικό επίπεδο. Οι διαφορετικοί μοριακοί υπότυποι, όπως οι αυλικού τύπου Α και Β, ο HER2+ και ο τριπλά αρνητικός (TNBC), παρουσιάζουν διαφορετικές κλινικές πορείες και ανταποκρίσεις στη θεραπεία. Πρόσφατες μελέτες υπογραμμίζουν ότι οι μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις, και ιδίως οι m6A και m5C, εμπλέκονται σε κρίσιμες διεργασίες που καθορίζουν την εξέλιξη της νόσου, όπως η πολλαπλασιαστική ικανότητα των κυττάρων, η μετανάστευση και η ανάπτυξη αντοχής στη θεραπεία. Παρά τη σημαντική πρόοδο στην κατανόηση των ενζύμων που ρυθμίζουν αυτές τις τροποποιήσεις, ο ακριβής προσδιορισμός των θέσεων, η κατανομή και η δυναμική των m6A και m5C στα ανθρώπινα mRNAs παραμένουν λιγότερο κατανοητές. Συνεπώς, η άμεση διερεύνησή τους στο πλαίσιο του καρκίνου του μαστού μπορεί να προσφέρει νέες διαγνωστικές και θεραπευτικές προσεγγίσεις. Στην παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκε μια ολοκληρωμένη και συστηματική μελέτη των μετα-μεταγραφικών τροποποιήσεων m6A και m5C σε καρκινικές κυτταρικές σειρές μαστού, αξιοποιώντας την τεχνολογία αλληλούχησης μέσω νανοπόρων σε συνδυασμό με κατάλληλη βιοπληροφορική ανάλυση. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν πέντε καρκινικές κυτταρικές σειρές που αντιπροσωπεύουν τους βασικούς μοριακούς υποτύπους του καρκίνου του μαστού (MCF-7, BT-474, BT-20, MDA-MB-231 και SK-BR-3), καθώς και η μη καρκινική σειρά MCF-10A ως φυσιολογικός μάρτυρας. Η βιοπληροφορική προσέγγιση ανέδειξε χιλιάδες πιθανές θέσεις m6A και m5C, από τις οποίες περίπου 1–2% χαρακτηρίστηκαν ως θέσεις «υψηλής εμπιστοσύνης» βάσει αυστηρών κριτηρίων, ώστε να ελαχιστοποιηθούν τα ψευδώς θετικά αποτελέσματα. Επιβεβαιώθηκε η ισχυρή προτίμηση της m6A στο συντηρημένο μοτίβο 5'-DRACH-3', που αναγνωρίζεται από το σύμπλοκο των μεθυλοτρανσφερασών METTL3/14, ενώ για την m5C εντοπίστηκαν πιο πολύπλοκα μοτίβα, με σημαντικό αριθμό θέσεων να συγκεντρώνονται στο μοτίβο 5'-CNGGG-3', χαρακτηριστικό για τη μεθυλοτρανσφεράση NSUN2. Και οι δύο τροποποιήσεις εμφανίστηκαν σε όλες τις περιοχές των mRNAs, με προτίμηση στις 3' UTRs και ιδιαίτερα κοντά στα κωδικόνια λήξης, ενώ η διαφορική ανάλυση μεταξύ καρκινικών και μη καρκινικών κυττάρων αποκάλυψε κυρίως αυξημένα επίπεδα μεθυλίωσης στις καρκινικές σειρές του μαστού. Η συγκριτική ανάλυση μεταξύ των διαφορετικών καρκινικών κυτταρικών σειρών αποκάλυψε τόσο κοινές όσο και ειδικές θέσεις μεθυλίωσης για κάθε μοριακό υπότυπο καρκίνου του μαστού, γεγονός που αντικατοπτρίζει τις μοριακές ιδιαιτερότητες και την ετερογένεια της νόσου. Επιπλέον, η συγκριτική ανάλυση μεταξύ των μοριακών υποτύπων αποκάλυψε κοινές θέσεις m6A και m5C σε όλες τις καρκινικές κυτταρικές σειρές, αλλά και μεγάλο αριθμό μοναδικών θέσεων, οι οποίες πιθανώς αντικατοπτρίζουν τις μοριακές ιδιαιτερότητες κάθε μοριακού υποτύπου. Παράλληλα, μελετήθηκε η λειτουργία δύο βασικών ενζύμων, της απομεθυλάσης ALKBH5 και της μεθυλοτρανσφεράσης NSUN2, μέσω γονιδιακής αποσιώπησης με το σύστημα CRISPR/Cas9. Η παρέμβαση αυτή οδήγησε σε σημαντικές αλλαγές στα επίπεδα των αντίστοιχων τροποποιήσεων, επιβεβαιώνοντας τον καθοριστικό τους ρόλο στη ρύθμιση του επιμεταγραφώματος. Συγκεκριμένα, η απώλεια της ALKBH5 συσχετίστηκε με αυξημένα επίπεδα m6A σε ορισμένα μόνο 5'-DRACH-3' μοτίβα, γεγονός που υποδηλώνει επιλεκτικότητα στη δράση της και πιθανή συμμετοχή επιπλέον ενζύμων στους μηχανισμούς απαλοιφής της m6A από τα mRNAs. Αντίστοιχα, η αποσιώπηση της NSUN2 μείωσε τα επίπεδα m5C σε μοτίβα όπου δρα το ένζυμο, ενώ η ανίχνευση νέων θέσεων μεθυλίωσης σε περιοχές που δεν είχαν προηγουμένως χαρακτηριστεί ενισχύει την υπόθεση ότι και άλλες μεθυλοτρανσφεράσες συμμετέχουν στη ρύθμιση των m5C τροποποιήσεων στα ανθρώπινα mRNAs. Ένα από τα σημαντικότερα επιτεύγματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής υπήρξε ο σχεδιασμός, η κατασκευή και η λειτουργική αξιολόγηση ενός καινοτόμου μοριακού εργαλείου, το οποίο συνδυάζει την καταλυτικά ανενεργή μορφή της πρωτεΐνης RfxCas13d (dRfxCas13d) με την απομεθυλάση ALKBH5, επιτρέποντας τη στοχευμένη απομεθυλίωση συγκεκριμένων θέσεων m6A σε ανθρώπινα mRNAs. Ο πλασμιδιακός φορέας Dem6A-Vec, που αναπτύχθηκε στο πλαίσιο αυτής της μελέτης, ενσωματώνει όλα τα απαραίτητα στοιχεία για τη συνέκφραση του συμπλόκου dRfxCas13d-ALKBH5 και του κατάλληλου gRNA, παρέχοντας ένα ενιαίο, «all-in-one» σύστημα υψηλής αποδοτικότητας και ειδικότητας. Η εφαρμογή του συστήματος σε ανθρώπινα κύτταρα ανέδειξε την ικανότητά του να προκαλεί ακριβή και επιλεκτική απομεθυλίωση σε προκαθορισμένες θέσεις m6A, χωρίς εκτός-στόχου επιδράσεις. Τα πειραματικά αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι η απαλοιφή της m6A σε επιλεγμένα mRNAs μπορεί να επηρεάσει τη σταθερότητά τους και, κατ’ επέκταση, να τροποποιήσει τη γονιδιακή έκφραση με υψηλή ακρίβεια και εξειδίκευση. Επιπλέον, η ανάλυση της δυναμικής των επιπέδων μεθυλίωσης έδειξε ότι η απομεθυλίωση που επιτυγχάνεται μέσω του συστήματος είναι παροδική και αναστρέψιμη, γεγονός που αντανακλά τη φυσική δυναμική του επιμεταγραφώματος. Η παροδικότητα αυτή εξαρτάται από τον χρόνο ημιζωής των mRNAs, από τη συνεχή παραγωγή νέων mRNAs, καθώς και από την παρουσία και την ενεργό έκφραση του πλασμιδιακού φορέα στα κύτταρα. Η δυνατότητα στοχευμένης, μη μόνιμης και ρυθμιζόμενης αλλαγής των επιπέδων μεθυλίωσης των m6A σε επίπεδο μεμονωμένων θέσεων αποτελεί τη βάση για τη διερεύνηση των λειτουργικών συνεπειών των μετα-μεταγραφικών τροποποιήσεων. Συνολικά, το σύστημα Dem6A-Vec παρέχει ένα ισχυρό, ευέλικτο και αναπαραγώγιμο εργαλείο για τη στοχευμένη επεξεργασία του RNA, επιτρέποντας την αποκρυπτογράφηση των μηχανισμών μετα-μεταγραφικής ρύθμισης, με άμεσες προοπτικές για την κατανόηση της βιολογίας του καρκίνου και την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών. Συνολικά, η παρούσα διατριβή καταδεικνύει ότι η συνδυαστική χρήση της τεχνολογίας αλληλούχησης τρίτης γενιάς μέσω νανοπόρων, προηγμένων βιοπληροφορικών εργαλείων και καινοτόμων μοριακών προσεγγίσεων, όπως το σύστημα που σχεδιάστηκε και εφαρμόστηκε για την στοχευμένη απομεθυλίωση θέσεων m6A, προσφέρει μια αξιόπιστη και ολοκληρωμένη χαρτογράφηση των μετα-μεταγραφικών τροποποιήσεων m6A και m5C στον καρκίνο του μαστού. Τελικά, η παρούσα διδακτορική διατριβή όχι μόνο παρέχει νέα γνώση για την παθογένεια και την ετερογένεια του καρκίνου του μαστού, αλλά ανοίγει και τον δρόμο για την αξιοποίηση των μετα-μεταγραφικών τροποποιήσεων ως πιθανών βιοδεικτών ή/και θεραπευτικών στόχων στο πλαίσιο της εξατομικευμένης ιατρικής.