Study of peroxisomal functions and interactions in C. elegans

Abstract

This thesis contains the main results of the research work I’ve conducted in the Neurogenetics and Aging lab headed by Professor Tavernarakis as part of my PhD studies from November 2016 to November 2025. This research work has primarily utilized the nematode C. elegans, a model organism with wide application in the study of cell biology. C. elegans is an organism with completely post mitotic somatic cells and an invariant development that always produces the exact same number of cells in the exact same way. It usually reproduces by self-fertilization of hermaphrodite individuals. This organism is ideal for in vivo microscopy studies, due to its small size and transparency. It’s also very useful for the study of aging and associated processes, due to its relatively quick life cycle. It has been widely used in forward genetics studies (utilizing mutagenesis) and is even more amenable to reverse genetic studies that target the functions of specific genes through transgenesis, CRISPR editing or RNA interference (which can be achieved simply via feeding the animals with double stranded RNA). The organism is also ideal for drug screening experiments. C. elegans has been successfully used in cell biology studies on, among others, development, aging, neuronal connectomics and signal transduction, unfolded protein responses, autophagy and various cell death pathways. It has even been successfully used to model human diseases including major neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s Disease, Parkinson’s Disease, Huntington’s Disease, and Duchenne Muscular Dystrophy through experimentation on actual conserved homologue genes or the transgenic expression of human disorder-associated genes. The main subject of this research work are peroxisomes. They are ubiquitous monomembranic eukaryotic organelles that play a central role in the metabolism of a cell. Peroxisomes are responsible for the oxidation of fatty acids that are unprocessable by the mitochondria such as VLCFAs, branched fatty acids, and mono- or poly-unsaturated fatty acids. They are also involved in anabolic processes, and especially in the synthesis of ether lipids that have critical roles in the physiological properties of membranes (including those of myelin) and the formation of lipid raft microdomains. Peroxisomes are additionally a hub of reactive oxygen species metabolism, as they produce a lot of them (especially H2O2) as byproducts of their enzymatic pathways, and are equipped with a series of anti-oxidant enzymes (including but not limited to peroxisomal catalase). Thus, they can be simultaneously a source and the first line of defense against oxidative stress. Furthermore, they are potentially involved in the responses to other types of internal or external stress, and undertake some unusual special roles in some organisms (including C. elegans, in which they are responsible for the production of development regulating pheromones).Peroxisomes have a complex biogenesis progress that can occur both de novo or through fission of existing organelles, and involves multiple steps from the formation of the initial monomembranic pre-peroxisomal vesicles to their full maturation through the import and incorporation of membrane and matrix proteins. The proteins that facilitate these biogenesis steps are called peroxins and are relatively conserved across species. Dysfunction in peroxisomal biogenesis or in the enzymes facilitating their metabolic functions is associated with the emergence of diseases in humans. A lot of these disorders can be quite severe and most feature neuropathological symptoms. There is also evidence linking peroxisomes with some types of neurodegenerative disease. These facts inspired the core aim of this research work: to investigate for potentially valuable novel functions and interactions of these organelles, especially in C. elegans neurodegeneration models. This investigation demonstrated partial efficacy in worm models of polyglutamine (polyQ) disorders. These are disorders that involve genes with long polyglutamine codon repeats that are abnormally expanded due to errors in DNA replication or repair, leading to the production of aggregate prone protein forms after translation. Polyglutamine aggregation can be observed at various forms and sizes, and there are disagreements as to whether larger aggregates are actually toxic, an incidental symptom, or an ineffective attempt at protecting the cell. There is evidence supporting every school of thought in this matter, and even some evidence suggesting that the RNA produced from the mutated genes is involved in the toxicity. There are nine of these disorders involving this type of defect in different proteins, with Huntington’s Disease and Machado-Joseph Disease being the most common.In C. elegans polyglutamine diseases are modelled through the transgenic expression of extended polyQ peptides or pathogenic forms of human genes. These transgenic models have been used to study the properties and kinetics of the aggregation and examine the effect of specific genes and drugs on the progression of the pathology. The experiments presented in this thesis primarily utilized three such models, expressing polyQ peptides in the animals’ body wall muscles, their intestine and a combination of both under an inducible promoter. In order to examine the effect of peroxisomes on these models, I subjected them to RNAi against the core factors of peroxisomal membrane and matrix import, the peroxins prx-19 and prx-5, respectively. These treatments were quite effective at delaying aggregation progression in all three models. In addition, I assessed the effect of these treatments on the lifespan of a polyQ transgenic model and in its capacity for mobility (as a measure of worm healthspan). However, I was unable to detect any beneficial effect on these metrics.The investigation on polyglutamine aggregation involved analyses of large volumes of fluorescence imaging data, a process that proved to be quite arduous and time consuming due to the need for the manual designation of Regions of Interest for each worm in every image used. In order to expedite the analysis without compromising experimental design and accuracy, I sought to introduce some automation to the process. This led to the development of SegElegans. SegElegans is a deep learning system that utilizes a special bifurcated U-net architecture in order to automatically generate segmentations of individual worms in widefield images, even in crowded images with touching and overlapping worms. It utilizes a single encoder and two decoders that are separately trained for the tasks of semantic segmentation (distinguishing worms from their background and detecting their borders) and skeleton segmentation, and a post-processing segment that combines the information from the two decoders in order to produce instance segmentations (accurate RoIs for each individual) of worms while accurately assigning overlapping parts to all interacting animals. Performance tests demonstrated that SegElegans had superior accuracy on this kind of worm segmentations than all alternative deep learning systems at the time of publication. In addition to the polyglutamine aggregation studies and the development of SegElegans, I conducted an RNA sequencing study in worms that travelled to the International Space Station as part of the ICE-2 (International C. elegans Experiment 2) mission, in order to determine whether peroxisomes were important for the adaptation of worms in these unusual conditions. The study involved wild type animals as well as animals with mutations in the hypoxia response and DNA damage response pathways. The detected changes in peroxisomal gene expression were minimal. Nevertheless, a more unbiased investigation on RNA levels from all C. elegans genes revealed some interesting findings, indicating that spaceflight induces significant changes in the organisms’ cuticle and extracellular matrix.

Η διατριβή αυτή πραγματεύεται τα κύρια αποτελέσματα της ερευνητικής μου δραστηριότητας στο εργαστήριο Νευρογενετικής και Γήρανσης του Κ. Νεκτάριου Ταβερναράκη. Η έρευνα διεξήχθη στα πλαίσια των διδακτορικών μου σπουδών από το Νοέμβριο 2016 μέχρι το Νοέμβριο 2025. Η έρευνά μου χρησιμοποίησε πρωτίστως τον νηματώδη C. elegans, έναν οργανισμό μοντέλο με πολλές εφαρμογές στη μελέτη της κυτταρικής βιολογίας. Ο C. elegans είναι ένας οργανισμός με εξ ολοκλήρου μεταμιτωτικά σωματικά κύτταρα και μια προκαθορισμένη και αμετάβλητη αναπτυξιακή διαδικασία που παράγει πάντα τον ίδιο ακριβώς αριθμό κυττάρων με τον ίδιο τρόπο. Αναπαράγεται συνήθως μέσω αυτογονιμοποίησης ερμαφρόδιτων ατόμων. Ο νηματώδης αποτελεί εξαιρετικό μοντέλο για μικροσκοπία in vivo (σε ζωντανούς/λειτουργικούς οργανισμούς), χάρη στο μικρό του μέγεθος και τη διαφάνειά του. Είναι επίσης πολύ χρήσιμος για τη μελέτη της γήρανσης και βιολογικών διαδικασιών που σχετίζονται με τη γήρανση χάρη στον σχετικά γρήγορο κύκλο ζωής του. Έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως σε μελέτες κλασσικής γενετικής (με τη χρήση μεταλλαξιγένεσης) και είναι ακόμα πιο πρόσφορος για μελέτες αντίστροφης γενετικής μέσω διαγονιδιακής τροποποίησης, τροποποίησης του DNA μέσω CRISPR και γονιδιακής καταστολής μέσω RNA (η τελευταία είναι ιδιαίτερα εύκολη στον C. elegans, καθώς επιτυγχάνεται απλά μέσω ταΐσματος με δίκλωνο RNA). Ο οργανισμός είναι επίσης ιδανικός για πειραματικούς ελέγχους φαρμάκων. Ο C. elegans έχει χρησιμοποιηθεί με μεγάλη επιτυχία σε μελέτες κυτταρικής βιολογίας πάνω σε διάφορα αντικείμενα, μέσα στα οποία συμπεριλαμβάνονται η ανάπτυξη, η γήρανση, η νευρωνική συνδεσμολογία και η νευροδιαβίβαση, οι μηχανισμοί αντίδρασης στη συσσώρευση μη διπλωμένων ή λάθος διπλωμένων πρωτεϊνών, η αυτοφαγία και διάφορα μονοπάτια κυτταρικού θανάτου. Έχει επίσης χρησιμοποιηθεί επιτυχώς ως μοντέλο για τη μελέτη ανθρωπίνων ασθενειών, όπως η νόσος του Alzheimer, η νόσος του Parkinson, η νόσος Huntington και η μυϊκή δυστροφία Duchenne, μέσω πειραμάτων πάνω σε συντηρημένα ομόλογα γονίδια του οργανισμού ή σε διαγονιδιακά ζώα που εκφράζουν ανθρώπινα γονίδια συσχετισμένα με παθολογίες.Το κύριο αντικείμενο αυτής της ερευνητικής δουλειάς είναι τα υπεροξειδιοσώματα, πανταχού παρόντα μονομεμβρανικά κυτταρικά οργανίδια που έχουν κεντρικό ρόλο στον μεταβολισμό των ευκαρυωτικών κυττάρων. Tα υπεροξειδιοσώματα είναι υπεύθυνα για την οξείδωση λιπαρών οξέων που δεν μπορούν να μεταβολιστούν από τα μιτοχόνδρια, όπως πολύ μακριά λιπαρά οξέα, διακλαδισμένα λιπαρά οξέα ή μονοακόρεστα και πολυακόρεστα λιπαρά οξέα. Επίσης εμπλέκονται σε αναβολικές διαδικασίες και ιδιαίτερα στη σύνθεση αιθερικών λιπιδίων με κρίσιμη συνεισφορά στη ρύθμιση των φυσικών ιδιοτήτων μεμβρανών (συμπεριλαμβανομένων των μεμβρανών της μυελίνης) και στον σχηματισμό μεμβρανικών υποπεριοχών. Αποτελούν επίσης κέντρο του μεταβολισμού ενεργών ριζών οξυγόνου, καθώς τις παράγουν (ιδίως H2O2) σε μεγάλες ποσότητες ως παραπροϊόντα των ενζυμικών τους διεργασιών, αλλά και ταυτόχρονα περιέχουν μια σειρά από αντιοξειδωτικά ένζυμα (συμπεριλαμβανομένης της υπεροξειδιοσωματικής καταλάσης). Συνεπώς είναι ταυτόχρονα πηγή και πρώτη γραμμή άμυνας απέναντι στο οξειδωτικό στρες. Παράλληλα, είναι συνδεδεμένα με μηχανισμούς αντιμετώπισης άλλων τύπων ενδογενούς και εξωγενούς στρες και σε κάποιους οργανισμούς είναι υπεύθυνα για ιδιαίτερους ρόλους (για παράδειγμα στον C. elegans είναι υπεύθυνα για την παραγωγή φερομονών που επηρεάζουν τις αναπτυξιακές διαδικασίες του οργανισμού).Τα υπεροξειδιοσώματα έχουν μία πολύπλοκη διαδικασία βιογένεσης και μπορούν να δημιουργηθούν τόσο de novo όσο και από τη διαίρεση προϋπαρχόντων υπεροξειδιοσωμάτων. Η διαδικασία αυτή περιλαμβάνει πολλά στάδια, ξεκινώντας από τη δημιουργία πρόδρομων μονομεμβρανικών κυστιδίων και καταλήγοντας στην ωρίμανση μέσω της εισαγωγής και ενσωμάτωσης πρωτεϊνών στην μεμβράνη και το εσωτερικό ("μήτρα") των οργανιδίων. Οι πρωτεΐνες που ρυθμίζουν και διευθετούν τη διαδικασία της βιογένεσης ονομάζονται υπεροξίνες και είναι σχετικά συντηρημένες μεταξύ διαφορετικών ευκαρυωτικών ειδών.Προβλήματα στην υπεροξειδιοσωματική βιογένεση ή σε συγκεκριμένα ένζυμα των μεταβολικών τους μονοπατιών έχουν συσχετιστεί με την εμφάνιση νοσημάτων στους ανθρώπους. Πολλές από τις σχετικές ασθένειες είναι ιδιαίτερα βαριές και η πλειοψηφία τους εμπεριέχει νευροπαθολογικά συμπτώματα. Παράλληλα υπάρχουν δημοσιευμένες ερευνητικές εργασίες που συνδέουν τα υπεροξειδιοσώματα με κάποιες μορφές νευροεκφυλιστικών νοσημάτων. Αυτά τα δεδομένα αποτέλεσαν την βασική έμπνευση για τον κύριο στόχο αυτής της ερευνητικής εργασίας: τη διερεύνηση και ανακάλυψη πιθανών νέων χρήσιμων λειτουργιών και αλληλεπιδράσεων των υπεροξειδιοσωμάτων, ιδιαίτερα σε μοντέλα νευροεκφυλισμού στον C. elegans. Η διερεύνηση αυτή οδήγησε στην εύρεση κάποιων αποτελεσμάτων σε μοντέλα πολυγλουταμινικών ασθενειών. Αυτές οι ασθένειες συνδέονται με γονίδια με μακριές επαναλήψεις κωδικονίων πολυγλουταμίνης που έχουν επεκταθεί πέραν του φυσιολογικού, λόγω σφαλμάτων στις διαδικασίες της αντιγραφής ή της επιδιόρθωσης του DNA. Αυτή η επέκταση οδηγεί στην παραγωγή πρωτεϊνών με επιρρέπεια προς τη συσσωμάτωση. Η πολυγλουταμινική συσσωμάτωση έχει διάφορες μορφές και μεγέθη, και το αν τα συσσωματώματα είναι πηγή της παθολογίας, σύμπτωμα ή ακόμα και ανεπαρκώς επιτυχής μηχανισμός άμυνας, είναι αντικείμενο επιστημονικής διαφωνίας. Υπάρχουν πειραματικά δεδομένα που στηρίζουν όλες τις παραπάνω απόψεις, ενώ παράλληλα υπάρχουν και δεδομένα που υποδεικνύουν ότι και το ίδιο το RNA που παράγεται από τα επεκταμένα γονίδια μπορεί να έχει τοξική δράση. Συνολικά υπάρχουν εννέα ανθρώπινες ασθένειες πολυγλουταμινικής επέκτασης με βλάβες σε διαφορετικές πρωτεΐνες. Οι πιο κοινές είναι η νόσος Huntington και η νόσος Machado-Joseph.Στον C. elegans οι πολυγλουταμινικές ασθένειες μοντελοποιούνται μέσω της διαγονιδιακής έκφρασης επεκταμένων πολυγλουταμινικών πεπτιδίων ή παθογενών αλληλικών μορφών ανθρωπίνων γονιδίων. Αυτά τα διαγονιδιακά μοντέλα έχουν χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη των ιδιοτήτων και της κινητικής της διαδικασίας της συσσωμάτωσης καθώς και της επίδρασης συγκεκριμένων γονιδίων και φαρμάκων στην παθολογία. Τα πειράματα που παρουσιάζονται σε αυτή τη διατριβή χρησιμοποίησαν κυρίως τρία τέτοια μοντέλα, που εκφράζουν πεπτίδια πολυγλουταμίνης στους σωματικούς μύες των σκουληκιών, στο έντερό τους, ή και στα δύο, υπό τον έλεγχο ενός ελεγχόμενου επαγώγιμου υποκινητή. Προκειμένου να ελέγξω την επίδραση των υπεροξειδιοσωμάτων σε αυτά τα μοντέλα, τα υπέβαλα σε γονιδιακή σίγηση μέσω RNAi, στοχεύοντας τις υπεροξίνες 5 και 19, που αποτελούν τους κεντρικούς παράγοντες της εισαγωγής πρωτεϊνών στη μεμβράνη και τη μήτρα. Αυτές οι παρεμβάσεις επέφεραν σημαντική καθυστέρηση της πολυγλουταμινικής συσσωμάτωσης και στα τρία μοντέλα. Επακολούθως έλεγξα την επίδραση αυτών των παρεμβάσεων στο προσδόκιμο επιβίωσης των σκουληκιών και τις κινητικές τους ικανότητες (ως μέτρο της υγείας τους κατά τη γήρανση), χωρίς θετικό αποτέλεσμα. Η διερεύνηση της πολυγλουταμινικής συσσωμάτωσης απαίτησε την ανάλυση μεγάλου όγκου φωτογραφιών από μικροσκοπία φθορισμού. Αυτή η ανάλυση αποδείχθηκε ιδιαίτερα επίπονη και χρονοβόρα λόγω της ανάγκης για τον χειροκίνητο καθορισμό ορίων επιλογής για κάθε σκουλήκι σε κάθε εικόνα. Προκειμένου να επιταχύνω τη διαδικασία χωρίς της απώλεια πειραματικής ακρίβειας (π.χ. με το να μειώσω τον αριθμό των ζώων ανά πείραμα), επέλεξα τη λύση της αυτοματοποίησης. Η αυτοματοποίηση αυτή επιτεύχθηκε με την ανάπτυξη του SegElegans, ενός συστήματος μηχανικής μάθησης που χρησιμοποιεί μία ειδική "δικέφαλη" αρχιτεκτονική τύπου U-net για να παράξει αυτόματα επιλογές για κάθε σκουλήκι ακόμα και σε εικόνες με μεγάλη "πληθυσμιακή πυκνότητα" και εφαπτόμενα/αλληλεπικαλυπτόμενα σκουλήκια. Το SegElegans χρησιμοποιεί έναν κωδικοποιητή και δύο αποκωδικοποιητές που είναι εκπαιδευμένοι χωριστά α) στην διάκριση των σκουληκιών από το φόντο της εικόνας και τον εντοπισμό των ορίων τους και β) στον εντοπισμό του "σκελετού" (μεσογραμμής) του κάθε ζώου. Αυτά τα δύο στοιχεία συνδυάζονται με τη βοήθεια ενός συστήματος μετα-επεξεργασίας που εντέλει παράγει ακριβείς επιλογές για κάθε ξεχωριστό σκουλήκι και αποδίδει σωστά κάθε περιοχή αλληλοεπικάλυψης σωμάτων σε όλα τα αλληλοεπιδρώντα άτομα. Έλεγχοι επίδοσης έδειξαν ότι το SegElegans είχε μεγαλύτερη ακρίβεια στην παραγωγή τέτοιων ορίων επιλογής στα σκουλήκια από οποιαδήποτε άλλη εναλλακτική κατά τον χρόνο της δημοσίευσης. Επιπλέον, πέρα από τις μελέτες της πολυγλουταμινικής συσσωμάτωσης και την ανάπτυξη του SegElegans, πραγματοποίησα μία μελέτη με αλληλούχηση RNA σε σκουλήκια που ταξίδεψαν στο Διεθνή Διαστημικό Σταθμό στα πλαίσια της αποστολής ICE-2 (International C. elegans Experiment 2), προκειμένου να εξακριβώσω αν τα υπεροξειδιοσώματα είναι σημαντικά για την προσαρμογή των σκουληκιών σε αυτές τις ασυνήθιστες συνθήκες. Η έρευνα αυτή χρησιμοποίησε ζώα αγρίου τύπου και ζώα με μεταλλαγές στο μονοπάτι αντιμετώπισης της υποξίας ή σε ένα μονοπάτι αντιμετώπισης ζημιάς στο DNA. Η ανάλυση υπέδειξε ελάχιστες αλλαγές στην έκφραση των γονιδίων των υπεροξειδιοσωμάτων. Ωστόσο, μία γενικότερη ανάλυση των επιπέδων RNA για όλα τα γονίδια του C. elegans επέφερε ενδιαφέροντα αποτελέσματα που δείχνουν ότι η πτήση στο διάστημα επάγει σημαντικές αλλαγές στην επιδερμίδα και τον εξωκυτταρικό χώρο των σκουληκιών.