Μελέτη ενζύμων του μεταβολισμού των υδατανθράκων που σχετίζονται με την παθοφυσιολογία του διαβήτη με έμφαση στην DPP-4 και PTP1b και της δυνατότητας εύρεσης ειδικών αναστολέων με πιθανή εφαρμογή στη θεραπεία και τη διαγνωστική

Abstract

Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM) is a multifactorial metabolic disease characterized mainly by chronic hyperglycemia and insulin resistance, accounting for approximately 90–95% of diabetes cases. The present doctoral dissertation focuses on the discovery of novel inhibitors of the enzymes DPP4 and PTP1b. Inhibition of DPP4 enhances glucose-dependent insulin secretion and improves β-cell function, while inhibition of PTP1b contributes to the reduction of insulin resistance. The aim of this thesis was the identification of novel DPP4 and PTP1b inhibitors with emphasis on allosteric inhibitors, the discovery of dual-acting inhibitors, as well as the investigation of DPP4 isoform variations in serum from patients with T2DM, other DPP4-related pathological conditions(cancer, Alzheimer’s disease), and healthy individuals. For this purpose, sixteen synthetic derivatives of 3-(benzo[d]thiazol-2-yl)-2-arylthiazolidin-4-one and nineteen plant-derived compounds were studied, of which eight were isolated from Thymus thracicus Velen and eleven from Centaurea bruguieriana subsp. belangeriana. For the separation of the isoforms, Western blot/immunoblot and chromatographic techniques were applied. Initially, computational docking analysis were performed to predict inhibitory activity, followed by in vitro enzyme assays. The type of inhibition was investigated through kinetic studies, with extensive analysis for DPP4 and determination of Km and Vmax values using Lineweaver–Burk plots. Based on these results, an improved predictive model was developed by introducing a Probability Factor(PF) to estimate IC50 values and facilitate compound selection for further studies. Regarding DPP4, the results demonstrated that twelve of the sixteen synthetic derivatives strongly inhibited the enzyme, with IC50 values in the nM range, while five exhibited higher potency than approved inhibitors. In addition, four compounds exhibited a type of inhibition other than competitive (allosteric or mixed). Among the plant-derived compounds from Thymus thracicus, seven inhibited DPP4, with four displaying non-competitive or mixed inhibition, whereas two compounds from Centaurea bruguieriana showed uncompetitive inhibition with IC50 values in the μM range. Concerning PTP1b, seven synthetic and ten plant-derived compounds showed notable inhibitory action with IC50 values in the μM range. Furthermore, six synthetic and seven plant-derived compounds exhibited a type of inhibition other than competitive (allosteric or mixed). Seven synthetic and eight plant-derived dual-acting inhibitors against both DPP4 and PTP1b were identified, with one synthetic and six plant-derived compounds, exhibiting allosteric or mixed inhibition toward both enzymes. Using electrophoresis, electrotransfer, and immunodetection techniques (Western blot/Immunoblot), as well as chromatographic methods, distinct DPP4 isoforms were identified in T2DM patients’ serum compared to other pathological conditions and healthy individuals. The observed differences concerned both molecular weight and isoelectric point. Following partial purification of the isoforms and testing with synthetic inhibitors, it was demonstrated that the studied competitive inhibitors acted competitively with isoform-dependent potency, whereas inhibitors exhibiting allosteric or mixed inhibition displayed different inhibition modes and potencies depending on the specific DPP4 isoform.

Ο Σακχαρώδης Διαβήτης τύπου 2 (ΣΔ2) αποτελεί μια πολυπαραγοντική μεταβολική νόσο, με κύρια χαρακτηριστικά τη χρόνια υπεργλυκαιμία και την αντίσταση στην ινσουλίνη, και αντιπροσωπεύει το 90–95% των περιπτώσεων διαβήτη. Η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώνεται στην αναζήτηση νέων αναστολέων των ενζύμων DPP4 και PTP1b. Η αναστολή της DPP4 βελτιώνει τη γλυκοζοεξαρτώμενη έκκριση ινσουλίνης και τη λειτουργία των β-κυττάρων, ενώ η αναστολή της PTP1b συμβάλλει στη μείωση της αντίστασης στην ινσουλίνη. Στόχος της διατριβής ήταν η ανακάλυψη νέων αναστολέων των DPP4 και PTP1b με έμφαση σε αλλοστερικούς αναστολείς, η εύρεση αναστολέων διπλής δράσης, καθώς και η μελέτη διαφοροποιήσεων των ισομορφών της DPP4 σε ορούς ασθενών με ΣΔ2, άλλων, συσχετιζόμενων της DPP4, παθολογικών καταστάσεων(καρκίνος, νόσος Alzheimer) και υγιών. Για τον σκοπό αυτό μελετήθηκαν δεκαέξι συνθετικά παράγωγα της 3-(βενζο[d]θειαζολ-2-υλ)-2-αρυλοθειαζολιδιν-4-όνης και δεκαεννέα ενώσεις φυτικής προέλευσης, εκ των οποίων οκτώ απομονώθηκαν από το φυτό Thymus thracicus Velen και έντεκα από το Centaurea bruguieriana subsp. belangeriana. Αρχικά εφαρμόστηκαν υπολογιστικές μελέτες πρόσδεσης (Docking Analysis) για την πρόβλεψη της ανασταλτικής δράσης, ακολουθούμενες από in vitro ενζυμικές δοκιμασίες. Ο τύπος αναστολής διερευνήθηκε μέσω κινητικών μελετών, με εκτενή ανάλυση για τη DPP4 και προσδιορισμό των παραμέτρων Km και Vmax με διαγράμματα Lineweaver–Burk. Με βάση τα αποτελέσματα αναπτύχθηκε βελτιωμένο μοντέλο πρόβλεψης, δημιουργώντας έναν Παράγοντα Πιθανότητας (PF) για την εκτίμηση των τιμών IC50 και την καλύτερη πρόβλεψη για επιλογή ενώσεων για περαιτέρω μελέτη. Όσον αφορά την DPP4, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι δώδεκα από τα δεκαέξι συνθετικά παράγωγα ανέστειλαν ισχυρά τη DPP4, με τιμές IC50 στην περιοχή των nM, ενώ πέντε παρουσίασαν ισχύ ανώτερη εγκεκριμένων αναστολέων. Παράλληλα, τέσσερις ενώσεις παρουσίασαν άλλο τύπο αναστολής πέραν του συναγωνιστικού(competitive). Από τις φυτικές ενώσεις του Thymus thracicus, επτά ανέστειλαν τη DPP4, με τέσσερις εξ αυτών να εμφανίζουν μη συναγωνιστικό(non-competitive) ή μεικτό τύπο αναστολής, ενώ από το Centaurea bruguieriana δύο εμφάνισαν ανταγωνιστική(uncompetitive) αναστολή με IC50 στην περιοχή των μΜ.Όσον αφορά την PTP1b, επτά συνθετικές και δέκα φυτικές ενώσεις παρουσίασαν αξιόλογη ανασταλτική δράση με IC50 στην περιοχή των μΜ. Παράλληλα, έξι συνθετικές και επτά φυτικές ενώσεις εμφάνισαν άλλο τύπο δράσης πέραν του συναγωνιστικού. Eντοπίστηκαν επτά συνθετικοί και οκτώ φυτικής προέλευσης αναστολείς διπλής δράσης έναντι DPP4 και PTP1b, με έναν και έξι αντίστοιχα να εμφανίζουν άλλο τύπο αναστολής και στα δύο ένζυμα. Με μεθόδους ηλεκτροφόρησης, ηλεκτρομεταφοράς και ανοσοανίχνευσης(Western blot/Immunoblot), καθώς και με χρωματογραφικές τεχνικές, αναδείχθηκαν διαφοροποιημένες ισομορφές της DPP4 σε ορούς ασθενών με ΣΔ2 σε σχέση με άλλες παθολογικές καταστάσεις και υγιείς. Οι διαφορές που εντοπίστηκαν ήταν τόσο στο μοριακό βάρος όσο και το ισοηλεκτρικό σημείο. Από τον εν μέρει καθαρισμό των ισομορφών και τη δοκιμασία συνθετικών αναστολέων διαπιστώθηκε ότι οι μελετώμενοι συναγωνιστικοί αναστολείς δρούσαν συναγωνιστικά με διαφορετική ισχύ εξαρτώμενη της ισομορφής, ενώ οι αναστολείς άλλου τύπου δρούσαν με διαφορετικό τύπο αναστολής και ισχύ, εξαρτώμενα από την ισομορφή.