Development of aptamer - based biosensors

Abstract

This Thesis explores the characterization and the application of aptamers in biosensors. The work is divided into two major parts. The first focuses on the comprehensive selection and evaluation of aptamer candidates for aflatoxin M1 (AFM1) and oxytetracycline (OTC). This process involved an in-depth biophysical characterization employing multiple techniques, including fluorescence polarization, circular dichroism (CD), isothermal titration calorimetry (ITC), induced circular dichroism (ICD), and thermal denaturation studies. These methods were used, not only to confirm binding affinity and specificity, but also to unravel secondary structure dynamics, binding thermodynamics, and conformational changes upon aptamer-target interaction. Importantly, the use of ICD in aptamer studies is introduced here for the first time. The second part of the thesis applies the most promising aptamer sequences in the design and development of fluorescence-based biosensors. These biosensors were implemented both in solution and on plastic surfaces. Among the sensor designs developed, a novel triple-helix-based sensor for AFM1 and aflatoxin B1 (AFB1) detection stands out, contributing an innovative structural approach to the aptasensor repertoire. The thesis underscores that a direct correlation exists between the comprehensive aptamer characterization and the subsequent performance, stability, and reliability of the biosensors constructed. One of the central findings of this research is that not all aptamers perform as reported in the literature. Many existing aptasensor platforms suffer from inconsistent or irreproducible results, a challenge that often stems from the absence of thorough biophysical validation of the aptamer-target interaction. This study reinforces the necessity of adopting robust characterization protocols and highlights that sensor performance cannot be separated from aptamer quality. The broader implication of this work extends beyond the specific analytes addressed here; it serves as a critical paradigm to the aptamer research community to re-evaluate existing practices and to promote more stringent standards in aptamer validation. Ultimately, this Thesis not only delivers novel biosensor platforms but also establishes a methodological framework for aptamer selection and validation that can be applied across diverse analytical contexts, with particular relevance to food safety.

Η παρούσα διατριβή ασχολείται με το χαρακτηρισμό και την εφαρμογή απταμερών σε βιοαισθητήρες. Η εργασία χωρίζεται σε δύο μέρη. Το πρώτο επικεντρώνεται στην αξιολόγηση και επιλογή απταμερών για την αφλατοξίνη Μ1 (AFM1) και την οξυτετρακυκλίνη (OTC). Η διαδικασία αυτή περιλάμβανε βιοφυσικό χαρακτηρισμό με τη χρήση πολλαπλών τεχνικών, όπως πολωσιμετρία φθορισμού (FP), κυκλικό διχροϊσμό (CD), θερμιδομετρία ισοθερμικής τιτλοδότησης (ITC), επαγόμενο κυκλικό διχροϊσμό (ICD) και μελέτες θερμικής αποδιάταξης. Οι μέθοδοι αυτές χρησιμοποιήθηκαν όχι μόνο για την επιβεβαίωση της συγγένειας και της εξειδίκευσης πρόσδεσης, αλλά και για την κατανόηση της δευτεροταγούς δομής, της θερμοδυναμικής της πρόσδεσης και των δομικών αλλαγών των απταμερών κατά την αλληλεπίδραση με το στόχο. Αξιοσημείωτο είναι ότι η χρήση του ICD σε απταμερή παρουσιάζεται εδώ για πρώτη φορά. Το δεύτερο μέρος της διατριβής αξιοποιεί τα περισσότερο υποσχόμενα απταμερή για το σχεδιασμό και την ανάπτυξη βιοαισθητήρων βασισμένων σε φθορισμό. Οι βιοαισθητήρες αυτοί αναπτύχθηκαν τόσο σε διάλυμα όσο και σε πλαστικές επιφάνειες. Ανάμεσα στις προσεγγίσεις αισθητήρων που αναπτύχθηκαν, ξεχωρίζει ένας καινοτόμος αισθητήρας βασισμένος σε τριπλή έλικα για την ανίχνευση των AFM1 και αφλατοξίνη Β1 (AFB1) ο οποίος συνεισφέρει μια νέα δομική προσέγγιση στο πεδίο των αισθητήρων απταμερών. Η μελέτη δείχνει ότι υπάρχει άμεση συσχέτιση μεταξύ του βιοφυσικού χαρακτηρισμού των απταμερών και της απόδοσης, σταθερότητας και αξιοπιστίας των παραγόμενων βιοαισθητήρων. Ένα από τα βασικά ευρήματα της έρευνας είναι ότι όλα τα απταμερή δεν αποδίδουν όπως περιγράφεται στη βιβλιογραφία. Πολλά απταμερή παρουσιάζουν ασυνεπείς ή μη αναπαραγώγιμες επιδόσεις, πρόβλημα που συχνά προκύπτει από την έλλειψη βιοφυσικής επικύρωσης της αλληλεπίδρασης απταμερούς-στόχου. Η παρούσα μελέτη ενισχύει την ανάγκη υιοθέτησης πρωτοκόλλων χαρακτηρισμού και υπογραμμίζει ότι η απόδοση ενός αισθητήρα δεν μπορεί να διαχωριστεί από την ποιότητα του απταμερούς. Τα συμπεράσματα αυτής της εργασίας δεν περιορίζονται στους επιλεγμένους αναλύτες αλλά αποτελούν μια πρόσκληση για επανεξέταση των υφιστάμενων πρακτικών χαρακτηρισμού. Τελικά, η παρούσα διατριβή όχι μόνο προσφέρει νέες πλατφόρμες βιοαισθητήρων, αλλά και καθιερώνει ένα μεθοδολογικό πλαίσιο για την επιλογή και την επικύρωση απταμερών, το οποίο μπορεί να εφαρμοστεί σε διάφορους τομές, όπως την ασφάλεια τροφίμων.