Βιοπληροφορική ανάλυση δεδομένων συστημικής βιολογίας για τη μοριακή μελέτη, χημειοπρόληψη και θεραπεία του ανθρώπινου ηπατοκυτταρικού καρκινώματος

Abstract

Hepatocellular carcinoma (HCC) - the most frequent subtype of liver cancer - is associated with high mortality due to its inherent heterogeneity, aggressiveness, and limited therapeutic regimes. HCC is a complex inflammation-related malignancy involving multiple genetic and epigenetic aberrations. The scope of this dissertation is the study and holistic investigation of underlying molecular mechanisms and characteristics of human HCC, as well as, the exploration of potential chemoprevention and/or therapeutic strategies, through systems biology and bioinformatics approaches. In this context, it has been previously shown by network analysis of proteomic data that the flavonoids epigallocatechin-3-gallate (EGCG) and fisetin (FIS) efficiently down-regulated pro-tumor cytokines released by HCC through inhibition of AKT/mTOR/RPS6 phospho-signaling. However, their mode of action at the global transcriptome level remains unclear. Therefore, the first part of this research endeavor attempts to compare gene expression alterations mediated by these compounds through a comprehensive transcriptome analysis based on RNA-sequencing (RNA-seq) in HEP3B, a responsive HCC cell line, upon perturbation with a mixture of prototypical stimuli mimicking conditions of tumor microenvironment, or under constitutive state. Analysis of RNA-seq data revealed extended changes on HEP3B transcriptome imposed by test nutraceuticals. Under stimulated conditions, EGCG and FIS significantly modified, compared to the corresponding control, the expression of 922 and 973 genes, respectively, the large majority of which (695 genes), was affected by both compounds. Hierarchical clustering based on the expression data of shared genes demonstrated an almost identical profile in nutraceutical-treated stimulated cells which was virtually opposite in cells exposed to stimuli alone. Downstream enrichment analyses of the co-modified genes uncovered significant associations with cancer-related transcription factors as well as terms of Gene Ontology (GO) and Reactome Pathways and highlighted extracellular matrix (ECM) dynamics as a nodal modulation point by nutraceuticals along with angiogenesis, inflammation, cell motility and growth. RNA-seq data for selected genes were independently confirmed by Real Time RT-qPCR. Overall, the present systems approach provides novel evidence, stepping up the mechanistic understanding of test nutraceuticals, thus rationalizing their clinical exploitation in new preventive/therapeutic modalities against HCC.In the second approach presented herein, 21 human HCC cell lines were analyzed to explore intertumor molecular diversity and pertinent drug sensitivity. An integrative computational approach based on exploratory and single-sample gene-set enrichment analysis of transcriptome and proteome data from the Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) was implemented, followed by correlation analysis of drug-screening data from the Cancer Therapeutics Response Portal (CTRPv2) with curated gene-set enrichment scores. Acquired results classified HCC cell lines into two groups, a poorly and a well-differentiated group, displaying lower/higher enrichment scores in a “Specifically Upregulated in Liver” gene-set, respectively. Hierarchical clustering based on a published epithelial–mesenchymal transition (EMT) gene expression signature further supported this stratification. Between-group comparisons of gene and protein expression unveiled distinctive patterns, whereas downstream functional analysis significantly associated differentially expressed genes with crucial cancer-related biological processes/pathways and revealed concrete driver-gene signatures. Finally, correlation analysis highlighted a diverse effectiveness of specific drugs against poorly compared to well-differentiated HCC cell lines, possibly applicable in clinical research with patients with analogous characteristics. Overall, this study expanded the knowledge on the molecular profiles, differentiation status, and drug responsiveness of HCC cell lines, and proposes a cost-effective computational approach to precision anti-HCC therapies.

Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (hepatocellular carcinoma - HCC) - το οποίο αποτελεί τον κυρίαρχο τύπο των νεοπλασιών του ήπατος - χαρακτηρίζεται από αυξημένη θνησιμότητα ως αποτέλεσμα της εγγενούς ετερογένειας, της επιθετικότητας της νόσου αλλά και των περιορισμένων διαθέσιμων θεραπευτικών προσεγγίσεων. Είναι ένας περίπλοκος τύπος νεοπλασίας που σχετίζεται άμεσα με την φλεγμονή, στον οποίο εμπλέκονται πολλαπλές γενετικές και επιγενετικές ανωμαλίες. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη και ολιστική διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών και χαρακτηριστικών του ανθρώπινου HCC καθώς και των δυνατοτήτων χημειοπρόληψης ή/και θεραπείας της νόσου μέσω προσεγγίσεων συστημικής βιολογίας και βιοπληροφορικής. Σε αυτό το πλαίσιο, προηγούμενη ερευνητική προσπάθεια έχει αναδείξει μέσω ανάλυσης δικτύων πρωτεωμικών δεδομένων ότι τα φλαβονοειδή επιγαλλοκατεχίνη του γαλλικού εστέρα (epigallocatechin-3-gallate - EGCG) καθώς και η φισετίνη (fisetin - FIS) παρουσιάζουν την ικανότητα να μειορυθμίζουν την απελευθέρωση προ-καρκινικών κυτταροκινών σε in-vitro μοντέλα HCC, μέσω της αναστολής της AKT/mTOR/RPS6 φωσφοσηματοδότησης. Εντούτοις, ο μηχανισμός δράσης αυτών των δύο ουσιών στο επίπεδο του συνολικού μεταγραφώματος δεν είναι ξεκάθαρος. Ως πρώτο βήμα λοιπόν, στην παρούσα ερευνητική προσέγγιση επιχειρείται, μέσω μιας ολοκληρωμένης ανάλυσης δεδομένων αλληλούχισης RNA (RNA-sequencing, RNA-seq), η μελέτη των μεταβολών στη γονιδιακή έκφραση ανθρώπινων κυττάρων της καρκινικής σειράς HEP3B, υπό την επίδραση των συγκεκριμένων ουσιών. Η δράση των ουσιών μελετήθηκε είτε σε βασικές συνθήκες, είτε ύστερα από διέγερση των κυττάρων με ένα μίγμα από προφλεγμονώδη ερεθίσματα (stimuli), έχοντας ως στόχο να προσομοιωθούν ρεαλιστικά οι πραγματικές συνθήκες που επικρατούν στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Η ανάλυση των δεδομένων της αλληλούχισης αποκάλυψε διευρυμένες αλλαγές στο μεταγράφωμα των κυττάρων υπό την επίδραση των υπό-εξέταση φαρμακοτροφίμων. Στην περίπτωση της διεγερμένης κατάστασης των κυττάρων, το EGCG και η FIS οδήγησαν στη στατιστικά σημαντική μεταβολή - σε σχέση με το αντίστοιχο δείγμα αναφοράς - της έκφρασης 922 και 973 γονιδίων, αντιστοίχως. Η πλειοψηφία των γονιδίων - συγκεκριμένα 695 τον αριθμό - είχαν κοινή επιρροή και από τις δύο εξεταζόμενες ουσίες. Εν συνεχεία, η ιεραρχική ομαδοποίηση (hierachical clustering) των επιπέδων έκφρασης των κοινών γονιδίων-στόχων κατέδειξε ένα πανομοιότυπο προφίλ έκφρασης για τα διεγερμένα κύτταρα υπό την επίδραση των φαρμακοτροφίμων, το οποίο προφίλ παρουσιάζεται ως ουσιαστικά αντίθετο από αυτόπου εμφανίζουν κύτταρα τα οποία έχουν εκτεθεί μονάχα στα προφλεγμονώδη ερεθίσματα. Κατάντη (downstream) αναλύσεις εμπλουτισμού με βάση τα κοινά γονίδια-στόχους των δύο ουσιών, αποκάλυψαν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις με καρκίνο-εμπλεκόμενους μεταγραφικούς παράγοντες, καθώς και όρους γονιδιακής οντολογίας (Gene Ontology - GO) αλλά και βιολογικών μονοπατιών της βάσης δεδομένων Reactome Pathway. Η ρύθμιση της δυναμικής κατάστασης και της οργάνωσης του υλικού της εξωκυττάριας μήτρας (extracellular matrix - ECM) αναδεικνύεται ως κεντρικός παράγοντας επίδρασης από τα εξεταζόμενα φλαβονοειδή, σε συνδυασμό με την αγγειογένεση, τη φλεγμονή, και την κυτταρική κινητικότητα και αύξηση. Στη συνέχεια, τα αποτελέσματα διαφορικής έκφρασης που προέκυψαν από την ανάλυση των δεδομένων αλληλούχισης, επιβεβαιώθηκαν ανεξαρτήτως για συγκεκριμένα αντιπροσωπευτικά γονίδια μέσω ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου, ύστερα από αντίστροφη μεταγραφή (Real Time RT-qPCR). Συνολικά, η παρούσα συστημική προσέγγιση παρέχει νέες πληροφορίες σχετικά με την δράση των συγκεκριμένων φαρμακοτροφίμων, συμβάλλοντας έτσι στην καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού δράσης τους. Παρουσιάζει επιπλέον, υποστηρικτικά στοιχεία σε σχέση με κάποια πιθανή μελλοντική εκμετάλλευση τους στα πλαίσια καινοτόμων χημειοπροστατευτικών/θεραπευτικών προσεγγίσεων απέναντι στο HCC. Σε δεύτερο στάδιο, αναλύθηκαν 21 ανθρώπινες HCC κυτταρικές σειρές (HCC-σειρές) με στόχο να διερευνηθεί η εγγενής μοριακή ποικιλομορφία της νόσου αλλά και η σχετιζόμενη ευαισθησία σε φάρμακα. Εφαρμόστηκε μια υπολογιστική προσέγγιση βασιζόμενη σε αρχική διερευνητική ανάλυση μεταγραφωμικών και πρωτεωμικών δεδομένων σε συνδυασμό με αποτελέσματα ανάλυσης εμπλουτισμού γονιδιακών σετ ανά δείγμα/κυτταρική σειρά. Εν συνεχεία ακολούθησε ανάλυση συσχετισμού της αποτελεσματικότητας ενός σημαντικού αριθμού φαρμάκων με συγκεκριμένα σκορ εμπλουτισμού γονιδιακών σετ (gene sets) που προέκυψαν ως ενδιαφέροντα κατά την πρότερη ανάλυση. Τα ομικά δεδομένα που χρησιμοποιήθηκαν είναι δημοσίως διαθέσιμα στην βάση δεδομένων Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE), ενώ τα δεδομένα του φαρμακευτικού ελέγχου για το πλήθος των ουσιών διατίθενται στο Cancer Therapeutics Response Portal (CTRPv2). Τα αποτελέσματα της συνολικής βιοπληροφορικής προσέγγισης οδήγησαν στην κατηγοριοποίηση των HCC-σειρών σε δύο ομάδες, ένα γκρουπ κακώς (poorly)- και ένα γκρουπ καλώς διαφοροποιημένων (well-differentiated) κυτταρικών σειρών με βάση τα χαμηλότερα ή υψηλότερα σκορ εμπλουτισμού για ένα συγκεκριμένο γονιδιακό σετ (“Specifically Up-regulated in Liver”). Περαιτέρω ιεραρχική ομαδοποίηση των HCC-σειρών με βάση μια πρόσφατα δημοσιευμένη γονιδιακή υπογραφή (gene signature) που σχετίζεται με την επιθηλιομεσεγχυματική μετάβαση (epithelial-mesenchymal transition - EMT) οδήγησε στην επιπλέον υποστήριξη αυτής της κατηγοριοποίησης. Η μεταξύ των δύο γκρουπ σύγκριση της γονιδιακής και πρωτεϊνικής έκφρασης αποκάλυψε διακριτά μοριακά μοτίβα, ενώ η κατάντη λειτουργική ανάλυση συσχέτισε κατά στατιστικά σημαντικό τρόπο τα διαφορικά εκφρασμένα γονίδια με βασικές καρκινο-συσχετιζόμενες βιολογικές διεργασίες και μονοπάτια και ανέδειξε συγκεκριμένες υπογραφές από κομβικά γονίδια-οδηγούς (driver-genes). Τέλος, η ανάλυση συσχετισμού της φαρμακευτικής απόκρισης των HCC-σειρών με τα σκορ εμπλουτισμού αυτών ως προς το γονιδιακό σετ προς μελέτη, οδήγησε στην καταγραφή μιας ποικίλης αποτελεσματικότητας συγκεκριμένων ουσιών ή/και φαρμάκων ενάντια στις HCC-σειρές, ανάλογα με το βαθμό της διαφοροποίησης τους. Συνολικά, αυτή η μελέτη διευρύνει την υπάρχουσα γνώση ως προς το μοριακό προφίλ, την κατάσταση διαφοροποίησης και την φαρμακευτική απόκριση ευρέως χρησιμοποιούμενων HCC-σειρών και προτείνει μια χαμηλού κόστους υπολογιστική προσέγγιση ως βάση για μελλοντικές στοχευμένες αντί-HCC θεραπείες.