Biomarker discovery through use of proteomics methodological approaches and technologies: a paradigm in the pathophysiology and clinical pathology – diagnostics of mastitis

Abstract

The general objective of this thesis was to study in depth, through the use of proteomics methodological approaches and technologies, the changes that occur in bacterial mastitis on the proteomes of the milk of goats and sheep, with the aim to transcribe the findings into practical diagnostic tools for diagnosis of the infection. Moreover, through the proteomics analysis of milk from sheep and goats, it was aimed to discover biomarkers, which would first elucidate the pathophysiology bacterial mastitis and second facilitate diagnosis of the infection. The specific objectives of the thesis were as follows: - (a) the detection of cathelicidin proteins in the milk of individual goats during the early stages of mastitis and their potential use for the diagnosis of mastitis at its early stage, - (b) the evaluation of the presence of cathelicidin proteins in the bulk-tank milk from goat and sheep farms, - (c) the investigation of the sequence of cathelicidin-1 detected in ewes’ milk in order to identify its unique peptides and core unique peptides, which would reveal potential targets for the accurate detection of the protein and the detection of unique sequences among the tryptic digest peptides of cathelicidin-1, which would improve accuracy of identification of the protein during targeted MS-based proteomics. Chapter I includes the review of the relevant literature. The Chapter is subdivided into two Parts. Part A appraises the international research output on the use of proteomics methodological approaches and technologies on the health management of sheep and goats, by means of a scientometrics study into the research output on sheep or goat work and proteomics. Part B appraises the international research output on the use of proteomics methodological approaches and technologies on mastitis, by means of a scientometrics study into the research output on mastitis work and proteomics. Chapter II presents an experimental study, after intramammary inoculation of Staphylococcus simulans to goats, bacteriological and cytological examinations of milk samples, as well as proteomics examinations [two-dimensional gel electrophoresis analysis (2-DE) and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF MS) analysis] were performed sequentially, from 4 to 48 h post-challenge. Cathelicidin-1 and cathelicidin-2 were detected consistently in milk samples obtained throughout the study, and spot optical densities obtained from PDQuest v.8.0 were recorded. Associations were calculated between the presence of mastitis in a mammary gland at a given timepoint and the detection of cathelicidin proteins in the respective milk sample. All inoculated mammary glands developed mastitis, confirmed by the consistent bacterial isolation from milk samples and the increased somatic cell content therein. Spot optical density of cathelicidin proteins was higher than in samples from contralateral mammary glands. There was a significant association between the presence of mastitis in a mammary gland and the detection of cathelicidin proteins in the respective milk sample; the overall accuracy was 81.8% (95% confidence interval: 70.4–90.2%). Chapter III presents a field study, in which the presence of cathelicidin proteins was evaluated in the bulk-tank milk of 32 dairy goat and 57 dairy sheep farms. In this work, no cathelicidin proteins were detected in any bulk-tank milk sample of goat, 0.0% (95% confidence interval: 0.0–10.7%), or sheep, 0.0% (95% confidence interval: 0.0–6.3%), farms. Chapter IV presents the results of a computational study, where cathelicidin-1 has been proposed as a potential biomarker for the early diagnosis of mastitis in ewes. The potential uniqueness of each peptide of cathelicidin-1 was investigated using a bioinformatics tool built on a big data algorithm. A set of core unique peptides (CUPs) was created and composite core unique peptides (CCUPs) were also searched. Further, the unique sequences in the tryptic digest peptides of cathelicidin-1 were also detected. Finally, the 3D structure of the protein was analyzed from predicted models of proteins. In total, 59 CUPs and four CCUPs were detected in cathelicidin-1 of sheep origin. Among tryptic digest peptides, there were six peptides that were unique in that protein. After 3D structure analysis of the protein, 37 CUPs were found on the core of cathelicidin-1 of sheep origin and among them, 29 were located on amino acids in regions of the protein with ‘very high’ or ‘confident’ estimates of confidence of the structure. Ultimately, the following six core unique peptides: QLNEQ, NEQS, EQSSE, QSSEP, EDPD, DPDS, are proposed as potential antigenic targets for cathelicidin-1 of sheep. Moreover, another six unique peptides were detected in tryptic digests and offer novel mass tags to facilitate the detection of cathelicidin-1 during MS-based diagnostics. In conclusion, the detection of cathelicidin proteins can offer increased accuracy for the early detection of mastitis in small ruminants; these biomolecules can act as biomarkers in individual animals. Post-infection, the detection of cathelicidin proteins in the milk of individual animals occurred earlier than the increase in somatic cell counts in milk from the same animals. This approach presents an advantage in that cathelicidin proteins can be used as a non-specific biomarker, as simply a ‘positive’ / ‘negative’ assessment would be sufficient. Moreover, the in silico analysis of cathelicidin-1 revealed six core unique peptides, which are proposed as potential antigenic targets for cathelicidin-1. However, their use for detection of mastitis at farm level, through their possible detection in the bulk-tank milk, remains unproven.

Η παρούσα διατριβή αποσκοπούσε στην εν τω βάθει μελέτη, μέσω της χρήσης πρωτεωμικών μεθοδολογικών προσεγγίσεων και τεχνολογιών, των μεταβολών στα πρωτεώματα του γάλακτος αιγών και προβάτων κατά τη βακτηριακή μαστίτιδα, με στόχο τη μεταγραφή των ευρημάτων ως διαγνωστικών εργαλείων για τη λοίμωξη. Επιπλέον, αποσκοπούσε στην ανάδειξη βιοδεικτών, για τη διαλεύκανση της λοίμωξης και τη διάγνωσή της. Οι ειδικότεροι στόχοι της διατριβής ήταν οι παρακάτω: - (α) η ανίχνευση καθελισιδινών στο γάλα αιγών κατά τα πρώιμα στάδια της μαστίτιδας και η πιθανή αξιοποίησή τους στη διάγνωση της λοίμωξης σε πρώιμο στάδιο, - (β) η ανίχνευση καθελισιδινών στο γάλα της παγολεκάνης από εκτροφές αιγών και προβάτων, - (γ) η διερεύνηση της αλληλουχίας της καθελισιδίνης-1 που ανιχνεύθηκε στο γάλα προβατίνων, αποσκοπώντας στον εντοπισμό μοναδικών πεπτιδίων και βασικών μοναδικών πεπτιδίων, τα οποία θα αποκάλυπταν πιθανούς στόχους για την ακριβή ανίχνευση της πρωτεΐνης, καθώς στον εντοπισμό μοναδικών αλληλουχιών στα παραγόμενα πεπτίδια μετά από θρυψινική πέψη της καθελισιδίνης-1, οπότε θα βελτιωνόταν η ακρίβεια της ταυτοποίησης της πρωτεΐνης κατά τη στοχευμένη πρωτεωμική ανάλυση με φασματομετρία μάζας. Στο Κεφάλαιο Ι περιλαμβάνεται η ανασκόπηση της σχετικής βιβλιογραφίας. Το κεφάλαιο υποδιαιρείται σε δύο μέρη. Στο Μέρος Α, αξιολογείται η διεθνής ερευνητική παραγωγή σχετικά με τη χρήση πρωτεωμικών μεθοδολογικών προσεγγίσεων και τεχνολογιών στη διαχείριση υγείας προβάτων και αιγών, μέσω επιστημομετρικής μελέτης της σχετικές ερευνητικής παραγωγής για το αντικείμενο ‘πρόβατα / αίγες και πρωτεωμική’. Στο Μέρος Β, αξιολογείται η διεθνής ερευνητική παραγωγή σχετικά με τη χρήση πρωτεωμικών μεθοδολογικών προσεγγίσεων και τεχνολογιών στη μαστίτιδα, ομοίως μέσω επιστημονομετρικής μελέτης. Στο Κεφάλαιο ΙΙ παρουσιάζεται πειραματική μελέτη, κατά την οποία πραγματοποιήθηκε ενδομαστικός ενοφθαλμισμός Staphylococcus simulans σε αίγες. Πραγματοποιήθηκαν διαδοχικές, από 4 έως 48 ώρες μετά τον ενοφθαλμισμό, δειγματοληψίες γάλακτος για βακτηριολογικές και κυτταρολογικές εξετάσεις, καθώς και πρωτεωμικές αναλύσεις (ανάλυση δισδιάστατης ηλεκτροφόρησης σε πηκτή (2-DE) και φασματομετρία μάζας MALDI-TOF MS). Ανιχνεύτηκαν σταθερά οι καθελισιδίνες-1 και -2 στα δείγματα γάλακτος και καταγράφηκαν οι οπτικές πυκνότητες κηλίδων από το λογισμικό PDQuest v.8.0. Επίσης, υπολογίστηκαν συσχετίσεις μεταξύ της παρουσίας μαστίτιδας σε μαστικό αδένα σε δεδομένη χρονική στιγμή και την ανίχνευση καθελισιδινών στο αντίστοιχο δείγμα γάλακτος. Βρέθηκε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της παρουσίας μαστίτιδας στους ενοφθαλμισμένους μαστικούς αδένες και την ανίχνευση καθελισιδινών στο γάλα αυτών. Η ολική ακρίβεια για τη διάγνωση της λοίμωξης βρέθηκε ότι ήταν 81,8%. Στο Κεφάλαιο ΙΙΙ, παρουσιάζεται μελέτη πεδίου, στην οποία αξιολογήθηκε η παρουσία καθελισιδινών στο γάλα της παγολεκάνης σε 32 αιγοτροφικές και 57 προβατοτροφικές εκμεταλλεύσεις. Σε αυτό το μέρος της μελέτης, δεν ανιχνεύθηκαν καθελισιδίνες σε κανένα δείγμα γάλακτος παγολεκάνης από αιγοτροφικές, 0,0% (διάστημα 95% εμπιστοσύνης: 0,0%–10,7%), ή προβατοτροφικές, 0,0% (διάστημα 95% εμπιστοσύνης: 0,0%–6,3%) εκμεταλλεύσεις. Στο Κεφάλαιο IV, παρουσιάζονται τα αποτελέσματα υπολογιστικής μελέτης, στην οποία η καθελισιδίνη-1 αξιολογήθηκε ως ενδεχόμενος βιοδείκτης για την έγκαιρη διάγνωση της μαστίτιδας στα πρόβατα. Η ενδεχόμενη μοναδικότητα κάθε πεπτιδίου της καθελισιδίνης-1 αξιολογήθηκε με τη χρήση βιοπληροφορικού εργαλείου βασισμένου σε αλγόριθμο μεγάλων δεδομένων. Δημιουργήθηκε ένα σύνολο βασικών μοναδικών πεπτιδίων (core unique peptides), ενώ αναζητήθηκαν και σύνθετα βασικά μοναδικά πεπτίδια (composite core unique peptides). Εντοπίστηκαν επίσης μοναδικές αλληλουχίες στα παραγόμενα πεπτίδια μετά από θρυψινική πέψη της καθελισιδίνης-1. Τέλος, αναλύθηκε η τρισδιάστατη δομή της πρωτεΐνης με τη χρήση προβλεπόμενων μοντέλων των πρωτεϊνών. Συνολικά, ανιχνεύθηκαν 59 βασικά μοναδικά πεπτίδια (core unique peptides) και τέσσερα σύνθετα βασικά μοναδικά πεπτίδια (composite core unique peptides) στην καθελισιδίνη-1 των προβάτων. Μεταξύ των παραγόμενων πεπτιδίων μετά από θρυψινική πέψη, υπήρχαν έξι που ήταν μοναδικά για την εν λόγω πρωτεΐνη. Μετά την ανάλυση της τρισδιάστατης δομής της πρωτεΐνης, εντοπίστηκαν 37 βασικά μοναδικά πεπτίδια (core unique peptides) στον πυρήνα της καθελισιδίνης-1, εκ των οποίων, τα 29 βρέθηκαν σε αμινοξέα σε περιοχές της πρωτεΐνης με εκτίμηση ‘πολύ υψηλής’ ή ‘αξιόπιστης’ βεβαιότητας της δομής της πρωτεΐνης. Τελικά, τα ακόλουθα έξι βασικά μοναδικά πεπτίδια (core unique peptides): QLNEQ, NEQS, EQSSE, QSSEP, EDPD, DPDS, προτείνονται ως πιθανοί αντιγονικοί στόχοι για την καθελισιδίνη-1 των προβάτων. Επιπλέον, ανιχνεύθηκαν ακόμη έξι μοναδικά παραγόμενα πεπτιδία μετά από θρυψινική πέψη, τα οποία θα προσφέρονταν για την ανίχνευση της καθελισιδίνης-1 κατά τη διάρκεια διαγνωστικών προσεγγίσεων με φασματομετρία μάζας. Συμπερασματικά, η ανίχνευση των βιομορίων καθελισιδίνης μπορεί να προσφέρει αυξημένη ακρίβεια στην έγκαιρη διάγνωση της μαστίτιδας στις αίγες. Μετά από ενδομαστική μόλυνση, η ανίχνευση των καθελισιδινών έλαβε χώρα πριν από την αύξηση του αριθμού των σωματικών κυττάρων στο γάλα των μολυσμένων ζώων. Η προσέγγιση αυτή παρουσιάζει πλεονέκτημα, καθώς οι καθελισιδίνες μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μη ειδικός βιοδείκτης, αφού η απλή αξιολόγηση ως ‘θετικό’ ή ‘αρνητικό’ θα ήταν επαρκής. Η in silico ανάλυση της καθελισιδίνης-1 αποκάλυψε έξι βασικά μοναδικά πεπτίδια, προτεινόμενα ως ενδεχόμενοι αντιγονικοί στόχοι για την καθελισιδίνη-1.