Επίδραση της δισφενόλης σε καλλιέργειες κυττάρων αναπαραγωγικού ιστού

Abstract

Introduction: Bisphenols (BPs), particularly bisphenol S (BPS), a structural analog of bisphenol A (BPA), are extensively utilized and have been shown to trigger oxidative stress, thereby suppressing cell proliferation and promoting apoptosis—processes that are fundamental for reproduction, pregnancy maintenance, and fertility. This study employs trophoblastic cells as an in vitro model to elucidate the molecular mechanisms underlying placenta-associated pregnancy complications following cytotoxic exposure to BPS. Materials and Methods: Human endometrial epithelial adenocarcinoma Ishikawa cells and trophoblastic cells were cultured and subsequently seeded into plates, followed by a 24-hour incubation with varying concentrations of bisphenol S (BPS). Cell viability was determined using the Countess Automated Cell Counter, with assessments performed after 48 hours for Ishikawa cells and after 24 hours for trophoblasts. The impact of siRNA on NANOG expression was analyzed by qRT-PCR, while the expression levels of DNMT and NANOG were quantified via qPCR, using G6PD as an internal reference gene. Results: Real-time PCR analysis demonstrated that DNMT1 gene expression in trophoblastic cells was dependent on BPS concentration. In Ishikawa cell lines, DNMT1 expression appeared elevated in association with increased cell numbers, though the fold change was not statistically significant. Comparative analysis revealed a significant difference in CpDNMT1 levels between trophoblasts exposed to BPS and unexposed controls, with higher values detected under BPS treatment (p = 0.019). The most pronounced difference was observed between BPS-treated Ishikawa cells and untreated trophoblasts (p < 0.001). Furthermore, silencing of the NANOG gene led to decreased DNMT1 expression, while G6PD expression remained consistently detectable. Conclusions: The findings of this study underscore the cytotoxic impact of BPS and its subsequent reduction of trophoblast viability. Moreover, the observed alterations in NANOG–DNMT1 gene expression in response to BPS exposure further support the role of endocrine-disrupting chemicals (EDCs) in mediating placental dysfunction.

Εισαγωγή: Οι δισφενόλες (BPs) και ιδιαίτερα η δισφενόλη S (BPS), ένα ανάλογο της δισφενόλης Α (BPA), χρησιμοποιούνται ευρέως και προκαλούν οξειδωτικό στρες, με αποτέλεσμα την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την πρόκληση απόπτωσης, που είναι κρίσιμα για την αναπαραγωγή, την εξέλιξη της εγκυμοσύνης και τη γονιμότητα. Η παρούσα διατριβή κάνει χρήση τροφοβλαστικών κύτταρα ως μοντέλο in vitro για να παρέχει στοιχεία και να διερευνήσει τις μοριακές αλληλεπιδράσεις σχετικά με τις επιπλοκές της εγκυμοσύνης που σχετίζονται με τον πλακούντα μετά από κυτταροτοξική έκθεση σε BPS. Υλικό και Μέθοδος: Καλλιεργήθηκαν κυτταρικές σειρές Ishikawa (από ανθρώπινο επιθηλιακό αδενοκαρκίνωμα του ενδομητρίου) και τροφοβλαστικά κύτταρα. Τα κύτταρα που ελήφθησαν από τις καλλιέργειες χωρίστηκαν σε τρυβλία και επωάστηκαν για 24 ώρες με διαφορετικές συγκεντρώσεις δισφενόλης S (BPS). Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον αυτόματο μετρητή κυττάρων και η βιωσιμότητα των κυττάρων Ishikawa αξιολογήθηκε μετά από 48 ώρες και για τους τροφοβλάστες μετά από 24 ώρες. Η επίδραση του siRNA στην έκφραση του NANOG αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας qRT-PCR. Η ποσοτικοποίηση των DNMT και NANOG πραγματοποιήθηκε με qPCR και το γονίδιο της G6PD χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Αποτελέσματα: Τα αποτελέσματα της real-time PCR έδειξαν ότι η έκφραση του γονιδίου DNMT1 ποικίλλει ανάλογα με τη συγκέντρωση του BPS στα τροφοβλαστικά κύτταρα. Στις κυτταρικές σειρές Ishikawa, τα αποτελέσματα της real-time PCR έδειξαν ότι η έκφραση του γονιδίου DNMT1 ήταν υψηλότερη λόγω της αύξησης των κυττάρων, αλλά η μετρούμενη αλλαγή διπλασιασμού δεν διέφερε στατιστικά σημαντικά. Η ανάλυση δεδομένων έδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ του CpDNMT1 σε τροφοβλάστες με και χωρίς BPS, όπου παρατηρήθηκαν υψηλότερες τιμές στην περίπτωση της παρουσίας BPS (p = 0,019). Η μεγαλύτερη διαφορά παρατηρήθηκε μεταξύ των τροφοβλαστών CpDNMT1 χωρίς BPS και του CpDNMT1 Ishikawa με BPS (p < 0,001). Η σίγαση του γονιδίου NANOG είχε ως αποτέλεσμα μειωμένη έκφραση του DNMT1, ενώ το γονίδιο G6PD εξακολουθούσε να ανιχνεύεται. Συμπεράσματα: Τα αποτελέσματα αυτής της διατριβής υπογραμμίζουν τις κυτταροτοξικές επιδράσεις της Δισφενόλης S και κατά συνέπεια την επίδρασή της στη βιωσιμότητα των τροφοβλαστών. Τα αποτελέσματα της έκφρασης του γονιδίου NANOG-DNMT1 που σχετίζεται με την έκθεση στο BPS ενισχύουν την κατανόησή μας για τη δυσλειτουργία του πλακούντα που προκαλείται από ενδοκρινικούς διαταράκτες.