Identification and validation of membrane cargo interactions in a model microbial eukaryote

Abstract

Proteins associated with cellular membranes constitute at least 1/3 of gene products in most organisms. The great majority of them are related to the ability of cells to communicate with their surroundings (e.g., transporters, channels, receptors, photosystems, etc.), or serve basic functioning of membranes (e.g., enzymes, cytoskeleton attachment). Understanding the structure and function of membrane proteins remains a challenge in large part due to the difficulty in establishing experimental conditions that can preserve their correct conformation and function when isolated from their native membrane environment. In eukaryotic cells, membrane proteins must be located in specific subcellular compartments to function properly. To that end, they follow the highly conserved vesicular-trafficking system to reach their appropriate destinations (Bonifacino and Glick, 2004). Conventionally, membrane proteins are co-translationally translocated to the endoplasmic reticulum (ER), where they are sorted into nascent ER-exit sites (ERES) and packaged into coated COPII secretory vesicles. These vesicles bud and fuse with the early-Golgi (cis-Golgi), before reaching the late-Golgi (trans-Golgi network or TGN) via Golgi maturation (Emr et al., 2009; Pantazopoulou and Glick, 2019). From the TGN, membrane proteins destined for the plasma membrane (PM) are secreted via AP1/clathrin-coated vesicles, a process regulated by Rab GTPases and requiring microtubule and actin polymerization (Pantazopoulou et al., 2014; Takeshita et al., 2014; Robinson, 2015; Pantazopoulou, 2016). Fusion between vesicular intermediates and target membranes is mediated by N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors (SNAREs), tethering proteins, small GTPases and other regulatory factors (Rothman, 1994; Jahn & Südhof, 1999; Rojas et al., 2012; Gillingham et al., 2014; Wu and Guo, 2015; Pinar and Peňalva, 2021). However, recent studies from our group in the model fungus Aspergillus nidulans have identified a novel Golgi-independent pathway for trafficking and translocation to the PM of major membrane proteins, such as nutrient transporters (e.g. UapA, AzgA, FurA), the proton pump ATPase PmaA, or the PalI alkaline pH-sensor component (Dimou et al., 2020; Dimou et al., 2022). Interestingly, cargoes bypassing the Golgi still necessitate functional core COPII components (e.g., Sec24, Sec13). This in turn strongly suggested that there must be two subpopulations of COPII vesicles exiting the ER. The first, the conventional one, is sorted to the early Golgi. The second, the one that deviates from the Golgi, is sorted to the PM either directly or via an unknown intermediate compartment. Notably, the Golgi-bypassing cargoes are localized rather homogenously at the PM of hyphae cells, in a non-polarized manner. In contrast, conventional membrane cargoes, such as chitin synthase (ChsB), lipid flippases (DnfA and DfnB) or the v/R-SNARE SynA, are highly polarized, located mainly in the apex of growing hyphae. What defines the composition of the two different types of COPII vesicles and what route is followed after ER-exit for the vesicles bypassing the Golgi remains unknown. A possible explanation could be that membrane cargoes themselves dictate their own trafficking routes and underlying mechanisms involved. Addressing how functionally distinct membrane cargoes contain the information to follow distinct trafficking routes would shed light on a basic cellular process in eukaryotes. The current thesis aims to provide mechanistic details underlying Golgi-bypass, using a multidisciplinary approach in the model filamentous fungus, A. nidulans. In the first part of the present thesis, I was involved in the development of a novel genetic tool to investigate vesicular secretion in A. nidulans. Specifically, together with my colleagues, Dr. Sofia Dimou and Georgia Sagia, we generated a system to monitor simultaneously the de novo localization of a Golgi-bypassing cargo, the well-studied uric acid transporter, UapA, versus the polarly localized v/R- SNARE, SynA. Using this system, we obtained multiple lines of evidence for the existence of distinct trafficking routes for these two cargoes, initiating at ERES and early secretory compartments. Most notably, in my work, I demonstrated that translocation of UapA to the PM is independent of Golgi maturation and the exocyst complex, thus challenging the prevailing dogma of anterograde membrane protein trafficking. This work highlighted that specific polarized and non-polarized PM cargoes serving different physiological functions follow distinct trafficking routes. In our systematic genetic approach, we investigated the effect of downregulation of known trafficking factors on UapA and SynA trafficking. However, to discover novel interactions underlying UapA translocation through the newly discovered Golgi-bypassing route, we sought an unbiased and robust biochemical approach capable of capturing transient protein–protein interactions in vivo. To this end, we developed, for the first time in A. nidulans and filamentous fungi in general, a functional system utilizing the TurboID biotin ligase (Branon et al., 2018) fused to UapA, and performed proximity-dependent biotinylation (PDB) assays coupled with DIA-MS. Using this methodology, we identified both expected and novel putative interactions that may be physiologically relevant to UapA trafficking. Among the most prominent trafficking-related hits were CopA (a component of the COPI coatomer), the Arf1 small GTPase (which drives COPI-mediated vesicle budding), and two Arf1 GTPase-activating proteins (GAPs), namely Glo3 and Gcs1. In my second year, I prioritized validating these interactions using reverse genetics, and found that the COPI coat indeed affects UapA secretion to the PM. To gain further mechanistic insight into vesicular trafficking, I also examined several upregulated proteins in our proteomic data that had not been previously linked to protein trafficking. I identified several homologues of ER–PM tethering proteins, which led me to question whether ER–PM contacts influence UapA or membrane protein secretion in general — a question not previously addressed in A. nidulans or any other system. Traditionally, ER–PM contact sites are thought to regulate lipid homeostasis and mediate non-vesicular trafficking of lipids, rather than protein trafficking. To explore the functional significance of ER–plasma membrane (ER–PM) contact sites in filamentous fungi, we identified and genetically characterized all A. nidulans proteins homologous to ER-PM contacts protein families (Snc2/VAP, Ist2, or tricalbins). We showed that the sole Scs2/VAP homolog, VapA, is essential for growth, and provide evidence that this requirement stems from a failure to maintain the polarized localization of specific cargoes at the hyphal apex. This defect correlates with depolarization of the AP-2 adaptor complex, which is required for apical cargo endocytosis (Martzoukou et al., 2017), and with disruptions in lipid homeostasis. Importantly, VapA deletion does not impair the trafficking, localization, or endocytosis of non-polarized nutrient transporters, suggesting that apical and subapical membrane cargoes depend differentially on partitioning into distinct lipid domains. Overall, this thesis provides novel mechanistic insights into membrane protein trafficking in A. nidulans, uncovering cargo-specific secretory routes, revealing an additional role for the COPI machinery in anterograde secretion, and highlighting the involvement of ER–PM contact sites in polarized cargo endocytosis.

Οι μεμβρανικές πρωτεΐνες αποτελούν τουλάχιστον το 1/3 των γονιδιακών προϊόντων στους περισσότερους οργανισμούς. Η πλειοψηφία αυτών σχετίζεται με την ικανότητα των κυττάρων να επικοινωνούν με το περιβάλλον τους (π.χ. μεταφορείς, δίαυλοι, υποδοχείς, φωτοσυστήματα) ή συμβάλλει σε βασικές λειτουργίες των μεμβρανών (π.χ. ένζυμα, σύνδεση με το κυτταροσκελετό). Η κατανόηση της δομής και της λειτουργίας των μεμβρανικών πρωτεϊνών παραμένει πρόκληση, κυρίως λόγω της δυσκολίας διατήρησης της φυσικής τους στερεοδιαμόρφωσης και λειτουργίας όταν απομονώνονται από το φυσικό τους μεμβρανικό περιβάλλον. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, οι μεμβρανικές πρωτεΐνες, προκειμένου να είναι λειτουργικές, χρησιμοποιούν μια συντηρημένη οδό κυστιδιακής μεταφοράς για να στοχευθούν σε συγκεκριμένα υποκυτταρικά διαμερίσματα. Κατά κανόνα, οι μεμβρανικές πρωτεΐνες παράγονται από ριβοσώματα που προσκολλώνται στο ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) κατά την μετάφραση. Έπειτα, οι μεμβρανικές πρωτεΐνες συγκεντρώνονται σε ειδικές θέσεις του ER, τα ER-exit sites (ERES), από όπου πακετάρονται σε εκκριτικά κυστίδια COPII. Αυτά τα κυστίδια συγχωνεύονται με το πρώιμο Golgi (early/cis-Golgi) και μέσω ωρίμανσης του Golgi καταλήγουν στο όψιμο Golgi (late/trans-Golgi network – TGN). Από το όψιμο Golgi, οι πρωτεΐνες που προορίζονται για την πλασματική μεμβράνη (PM) εκκρίνονται μέσω κυστιδίων καλυμμένων με AP1/clathrin, υπό την ρύθμιση των Rab GTPασών και με τη συμμετοχή του κυτταροσκελετού ακτίνης και των μικροσωληνίσκων. Η σύντηξη των κυστιδιακών ενδιάμεσων με τις μεμβράνες στόχους πραγματοποιείται μέσω SNAREs, πρωτεϊνών αγκυροβόλησης, μικρών GTPασών και άλλων ρυθμιστικών παραγόντων. Πρόσφατες μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας στο μοντέλο νηματώδη μύκητα Aspergillus nidulans, αποκάλυψαν μία ανεξάρτητη από το Golgi πορεία μεταφοράς μεμβρανικών πρωτεϊνών προς την πλασματική μεμβράνη. Αυτό το εναλλακτικό μονοπάτι στόχευσης εντοπίστηκε σε μεταφορείς θρεπτικών ουσιών, όπως στον μεταφορέα ουρικού οξέος και ξανθίνης (UapA) και άλλων θρεπτικών (AzgA, FurA, κτλ), στην αντλία πρωτονίων (PmaA), και στον αισθητήρα αλκαλικού pH (PalI). Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι τα φορτία που παρακάμπτουν το Golgi εξακολουθούν να απαιτούν βασικά συστατικά του συμπλέγματος COPII (π.χ. Sec24, Sec13), γεγονός που υποδηλώνει την ύπαρξη δύο υποπληθυσμών COPII κυστιδίων: ο ένας κατευθύνεται στο Golgi, ενώ ο άλλος στο PM είτε απευθείας είτε μέσω άγνωστου ενδιάμεσου διαμερίσματος. Τα φορτία που ακολουθούν την εναλλακτική οδό κατανέμονται ομοιογενώς στην πλασματικής μεμβράνη των υφών (‘μη-πολικά’ φορτία), ενώ μεμβρανικές πρωτεΐνες που σχετίζονται με την αύξηση της υφής, συγκεντρώνονται στο άκρο των υφών (‘πολικά’ φορτία όπως ChsB, DnfA/B, SynA). Η σύνθεση των δύο τύπων COPII κυστιδίων και η ακριβής διαδρομή των κυστιδίων που παρακάμπτουν το Golgi, παραμένουν άγνωστες. Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι το ίδιο το φορτίο καθορίζει τη διαδρομή μεταφοράς του. Η παρούσα διατριβή στοχεύει στη διερεύνηση των μηχανισμών που διέπουν την ανεξάρτητη από Golgi διακίνηση μεμβρανικών πρωτεϊνών, χρησιμοποιώντας μια διεπιστημονική προσέγγιση στο A. nidulans. Στο πρώτο μέρος, συμμετείχα στην ανάπτυξη ενός νέου γενετικού εργαλείου για τη μελέτη της εκκριτικής οδού. Μαζί με τις συναδέλφους μου, Dr. Σοφία Δήμου και Γεωργία Σαγιά, χρησιμοποιήσαμε ένα νέο σύστημα για ταυτόχρονη παρακολούθηση του νέο-συντιθέμενου και μη-πολικού φορτίου, UapA, έναντι της πολικής μεμβρανικής πρωτεΐνης, SynA. Χρησιμοποιώντας αυτό το εργαλείο, δείξαμε ότι τα δύο φορτία ακολουθούν διαφορετικές διαδρομές έκκρισης, με αφετηρία τα ERES. Σημαντικό είναι το εύρημα ότι η μετατόπιση του UapA στην πλασματική μεμβράνη είναι ανεξάρτητη από την ωρίμανση του Golgi, αμφισβητώντας το καθιερωμένο μοντέλο κυστιδιακής μεταφοράς. Αφού διερευνήθηκε η επίδραση της καταστολής γνωστών παραγόντων μεταφοράς στη διακίνηση του UapA και του SynA, στην συνέχεια χρησιμοποιήθηκε μια ευαίσθητη μεθοδολογία για την εύρεση νέων in vivo αλληλεπιδράσεων που σχετίζονται με την πορεία έκκρισης στον A. nidulans. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιώντας τον UapA, ως μεμβρανικό φορτίο, εφαρμόστηκε η τεχνική της βιοτινυλύωσης-εξαρτώμενης από τυπολογική εγγύτητα (proximity-dependent biotinylation), σε συνδυασμό με υγρή χρωματογραφία με φασματομετρία μάζας (LC-MS/MS), για πρώτη φορά σε νηματώδεις μύκητες. Με αυτόν τον τρόπο, εντοπίστηκαν αναμενόμενες αλλά και νέες πιθανές αλληλεπιδράσεις σχετικές με την έκκριση του UapA, όπως με το CopA (συστατικό του καλύμματος COPI), την Arf1 GTPάση, και δύο GAPs (Glo3, Gcs1). Με αντίστροφη γενετική, επιβεβαιώθηκε έπειτα ότι το COPI και η Arf1 χρειάζονται για την έκκριση του UapA προς την PM. Για περαιτέρω κατανόηση της κυτταρικής έκκρισης, διερευνήθηκαν επίσης πρωτεΐνες που δεν είχαν προηγουμένως συνδεθεί με την κυστιδιακή μεταφορά. Ειδικότερα, εντοπίστηκαν ομόλογα πρωτεϊνών που συμμετέχουν στις επαφές ER–PM, και εν συνεχεία τέθηκε το ερώτημα, αν οι εν λόγω επαφές επηρεάζουν τη μεταφορά μεμβρανικών πρωτεϊνών στο A. nidulans, ένα θέμα που γενικά δεν έχει προηγουμένως διερευνηθεί. Παραδοσιακά, οι επαφές ER–PM συμμετέχουν στην ομοιόσταση λιπιδίων και όχι στην πρωτεϊνική έκκριση. Ωστόσο, χαρακτηρίστηκαν γενετικά όλα τα ομόλογα των σχετικών πρωτεϊνικών οικογενειών (Snc2/VAP, Ist2, tricalbins), και φάνηκε ότι το μοναδικό ομόλογο της οικογένειας Scs2/VAP, η VapA, είναι απαραίτητο για την ανάπτυξη του μύκητα, συμμετέχοντας στην διατήρησης της πολικότητας της υφής. Τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν ότι ο πιθανός μηχανισμός είναι ο εξής: το VapA μέσω ρύθμισης των λιπιδίων της μεμβράνης, επηρεάζει την στρατολόγηση του συμπλόκου AP-2 στην PM και μετέπειτα την AP-2-εξαρτώμενη ενδοκύττωση των πολικών μεμβρανικών πρωτεϊνών (όπως οι λιπιδικές φλιπάσες DnfA και DnfB). Από την άλλη, παρά την σημασία του VapA για στην φυσιολογική ανάπτυξη της υφής, οι μη-πολικές μεμβρανικές πρωτεΐνες (όπως οι μεταφορείς) δεν επηρεάζονται από την διαγραφή του, επιδεικνύοντας έτσι μια σημαντική διαφορά μεταξύ των αλληλεπιδράσεων πολικών και μη-πολικών μεμβρανικών πρωτεϊνών με τα λιπίδια των μεμβρανών. Συνολικά, η παρούσα διατριβή παρέχει νέες μηχανιστικές γνώσεις σχετικά με την έκκριση μεμβρανικών πρωτεϊνών στο A. nidulans, αποκαλύπτοντας εξειδικευμένες διαδρομές έκκρισης, νέο ρόλο του COPI στα πρωταρχικά στάδια της έκκρισης, και τη συμμετοχή των επαφών ER–PM στην ενδοκύττωση των πολικών φορτίων.