Structural and functional analysis of the clonotypic B cell receptor in patients with B cell lymphomas

Abstract

B-cell lymphomas, including chronic lymphocytic leukemia (CLL) and splenic marginal zone lymphoma (SMZL), as well as pre-lymphomatous conditions, including CLL-like monoclonal B lymphocytosis (MBL), exemplify the close interplay between clonal evolution, antigen selection, and immune regulation. At the heart of this process lies the clonotypic B-cell receptor immunoglobulin (BcR IG), which not only mediates interactions with the microenvironment but also carries the molecular imprints of past and ongoing antigenic encounters. Despite decades of research, the precise contribution of the BcR to lymphomagenesis remains incompletely understood. This thesis aimed to dissect the immunogenetic, molecular, and functional properties of the BcR IG across different stages and subtypes of B-cell malignancies, with the aim of clarifying how BcR-mediated signaling and (auto)antigen reactivity shape disease onset, heterogeneity, and evolution. In Part I, we investigated CLL-like MBL, the recognized precursor condition to CLL. High-throughput sequencing, intraclonal diversification analysis, gene expression and (auto)antigen reactivity profiling supported that low-count and high-count CLL-like MBL are biologically distinct entities. Importantly, clonal size, repertoire restrictions, and somatic hypermutation (SHM) patterns emerged as early determinants of progression risk, underscoring the central role of BcR-mediated dynamics in the transition to overt leukemia. In Part II, we focused on CLL stereotyped subset #201, defined by the expression of IGHV4-34/IGLV1-44 BcRs. We demonstrated that SHM recurrently introduces N-linked glycosylation motifs into the variable domains. Functional assays with recombinant monoclonal antibodies revealed that these motifs significantly modulate (auto)antigen-binding capacity, narrowing polyreactivity and refining antigen recognition. These results highlight SHM-induced glycosylation as an important mechanism shaping CLL biology. In Part III, we dissected the immune dynamics, of CLL stereotyped subset #4, a clinically indolent and biologically distinctive subgroup of CLL, defined by the expression of IGHV4-34/IGKV2-30 BcR of the gamma isotype (IgG+). Compared with non-subset IGHV4-34 CLL, subset #4 displayed greater intraclonal diversity and evidence of ongoing clonal evolution. A minor IgM+ subpopulation was consistently detected alongside the dominant IgG+ clone. Within this IgM+ cell fraction we detected IGHV4-34 gene rearrangements clonally related to the dominant IgG+ clonotype. Clonotypic IGHV4-34 gene rearrangements within both subpopulations (IgM+, IgG+) were broadly polyreactive, while somatically hypermutated IgG+ clonotypes showed a more narrow and attenuated antigen binding. Transcriptomic profiling indicated metabolic activity in IgM+ cells and functional anergy in IgG+ cells, alluding to distinct evolutionary trajectories. Collectively, these findings refine the immunogenetic and functional profile of subset #4 and highlight the value of combining high-throughput repertoire analysis with transcriptomic profiling to unravel the mechanisms of clonal dynamics in CLL. In Part IV, we provided a comprehensive structural and functional analysis of the clonotypic BcR IG in SMZL. SMZL-derived BcR IGs were consistently auto/polyreactive, binding to a broad spectrum of self-antigens and microbial targets. Particularly notable was the role of IGHV1-2*04, which encodes a unique tryptophan residue at position 75 of the VH FR3 (W75) that critically shapes antigen binding and BcR self-association. Mutagenesis experiments showed that W75 alters (auto)antigen reactivity, while structural studies revealed conserved BcR homotypic interactions. Altogether, these results highlight how SMZL pathogenesis is likely fueled by a combination of chronic antigen-dependent and antigen-independent BcR signaling, offering mechanistic insights with potential therapeutic relevance. Overall, this work underscores that the natural history of B-cell malignancies is intricately connected to the biology of the BcR IG. Antigenic drive, clonal evolution, and autonomous signaling form an interwoven triad that determines clonal fate across the spectrum from MBL to overt lymphoma and leukemia. By elucidating the molecular and structural basis of these processes, this thesis advances our understanding of disease ontogeny and evolution, while also pointing to new opportunities for targeted intervention.

Τα λεμφώματα των ώριμων Β λεμφοκυττάρων, όπως η χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (ΧΛΛ) και το σπληνικό λέμφωμα οριακής ζώνης (ΣΛΟΖ), καθώς και προλεμφωματώδεις καταστάσεις, όπως η μονοκλωνική Β λεμφοκυττάρωση (ΜΒΛ), αποτελούν πεδία όπου η αντιγονική επιλογή, η κλωνική εξέλιξη και η άνοση ρύθμιση συνδιαμορφώνουν τη φυσική ιστορία τους. Στον πυρήνα αυτής της διαδικασίας βρίσκεται ο κλωνοτυπικός Β κυτταρικός υποδοχέας (ΒκΥ), ο οποίος όχι μόνο μεσολαβεί στις αλληλεπιδράσεις με το μικροπεριβάλλον, αλλά φέρει και τις μοριακές υπογραφές παλαιότερων και συνεχιζόμενων αντιγονικών αλληλεπιδράσεων. Παρά την εκτενή έρευνα, η ακριβής συμβολή του ΒκΥ στη λεμφωματογένεση παραμένει ατελώς κατανοητή. Σκοπός της διατριβής ήταν η λεπτομερής μελέτη των ανοσογενετικών, μοριακών και λειτουργικών χαρακτηριστικών του κλωνοτυπικού ΒκΥ σε διακριτά στάδια και υποτύπους λεμφωμάτων ώριμων Β λεμφοκυττάρων, από την ΜΒΛ έως τη ΧΛΛ και το ΣΛΟΖ, με στόχο τη διευκρίνιση του τρόπου με τον οποίο η σηματοδότηση μέσω του ΒκΥ και η αντιγονική αντιδραστικότητα επηρεάζουν την έναρξη, την ετερογένεια και την εξέλιξη της νόσου. Η μεθοδολογία συνδύασε αλληλούχηση υψηλής απόδοσης των αναδιατάξεων του ΒκΥ και ανάλυση της υποκλωνικής αρχιτεκτονικής, αλληλούχηση του μεταγραφώματος, παραγωγή ανασυνδυασμένων μονοκλωνικών αντισωμάτων και ανάλυση του προφίλ αντιδραστικότητας αυτών, έλεγχος της λειτουργικότητας σηματοδότησης, καθώς και δομικές/κρυσταλλογραφικές αναλύσεις των ΒκΥ, επιτρέποντας τη διασύνδεση της δομής και της λειτουργίας των ΒκΥ. Στο Μέρος Ι, μελετήθηκε η ΜΒΛ, το πρόδρομο στάδιο της ΧΛΛ. Η συνδυαστική ανάλυση με αλληλούχηση υψηλής απόδοσης, αξιολόγηση της ενδοκλωνικής ετερογένειας και χαρακτηρισμό του προφίλ της αντιγονικής αντιδραστικότητας ανέδειξε ότι η low-count και η high-count ΜΒΛ αποτελούν βιολογικά διακριτές οντότητες. Το μέγεθος του κλώνου, η επιλεκτικότητα του ρεπερτορίου και τα πρότυπα ΣΥΜ αναδείχθηκαν ως πρώιμοι καθοριστικοί παράγοντες του κινδύνου εξέλιξης, ενώ παρατηρήθηκαν διαφοροποιήσεις στη σηματοδότηση μέσω του ΒκΥ και σε συναφείς οδούς (FoxO, Wnt, VEGF) υπογραμμίζοντας τον κεντρικό ρόλο του ΒκΥ στη μετάβαση σε λευχαιμία. Συμπληρωματικά, καταγράφηκε αυτόνομη σηματοδότηση και των ΜΒΛ ΒκΥ, αν και σε μικρότερη ένταση από τη ΧΛΛ, στοιχείο που υποστηρίζει την ύπαρξη του φαινομένου της αυτόνομης σηματόδοτησης ήδη από το πρόδρομο στάδιο της ΜΒΛ. Συνολικά, τα δεδομένα υποστηρίζουν ότι η low-count ΜΒΛ αντανακλά μια ένα καλά ρυθμισμένο σύστημα κλωνικής ισορροπίας και όχι ένα προ-λευχαιμικό στάδιο που στη συνέχεια θα μπορούσε να εξελιχθεί σε ΧΛΛ. Στο Μέρος II, εστιάσαμε στο στερεότυπο υποσύνολο #201 της ΧΛΛ που χαρακτηρίζεται από την χρήση των IGHV4-34/IGLV1-44 ΒκΥ. Με αλληλούχηση υψηλής απόδοσης, τεκμηριώθηκε ότι η ΣΥΜ εισάγει επαναλαμβανόμενα μοτίβα N-γλυκοζυλίωσης στις μεταβλητές περιοχές των γονιδίων του ΒκΥ. Λειτουργικές αναλύσεις με ανασυνδυασμένα μονοκλωνικά αντισώματα αποκάλυψαν ότι αυτές οι θέσεις τροποποιούν πολύ την ικανότητα σύνδεσης (αυτο)αντιγόνων, περιορίζοντας την πολυαντιδραστικότητα και βελτιώνοντας την αναγνώριση αντιγόνων. Αυτά τα αποτελέσματα αναδεικνύουν την Ν-γλυκοζυλίωση που μεσολαβείται από τη ΣΥΜ ως ένα σημαντικό μηχανισμό που εμπλέκεται στη βιολογία της ΧΛΛ. Στο Μέρος III, αναλύσαμε την δυναμική του στερεότυπου υποσυνόλου #4 της ΧΛΛ, μιας κλινικά ήπιας και βιολογικά διακριτής υποομάδας ΧΛΛ, που ορίζεται από την έκφραση IGHV4-34/IGKV2-30 ΒκΥ. Σε σύγκριση με ασθενείς ΧΛΛ με ΒκΥ που δεν ανήκουν σε κάποιο στερεότυπο υποσύνολο, το υποσύνολο #4 παρουσίασε μεγαλύτερη ενδοκλωνική ετερογένεια και ενδείξεις συνεχιζόμενης κλωνικής εξέλιξης. Σε όλους τους ασθενείς, παράλληλα με τον κυρίαρχο κλώνο IgG+ ανιχνεύθηκε ένας μικρός υποπληθυσμός IgM+. Στον συγκεκριμένο πληθυσμό εντοπίστηκαν κλωνοτυπικές αναδιατάξεις IGHV4-34. Μη μεταλλαγμένοι κλωνότυποι και στους δυο υποπληθυσμούς ήταν ευρέως πολυαντιδραστικοί, ενώ οι μεταλλαγμένοι κλωνότυποι IgG+ εμφάνισαν μειωμένη αντιγονική αντιδραστικότητα. Η ανάλυση μεταγραφώματος αποκάλυψε έντονη μεταβολική δραστηριότητα στα IgM+ κύτταρα και λειτουργική ανέργια στα IgG+ κύτταρα, υποδηλώνοντας διακριτές εξελικτικές πορείες. Συνολικά, αυτά τα ευρήματα βελτιώνουν τις γνώσεις μας σχετικά με το ανοσογενετικό και λειτουργικό προφίλ του στερεότυπου υποσυνόλου #4 της ΧΛΛ και υπογραμμίζουν την αξία του συνδυασμού της ανάλυσης ρεπερτορίου υψηλής απόδοσης με την ανάλυση μεταγραφώματος για την αποκάλυψη των μηχανισμών της κλωνικής δυναμικής στη ΧΛΛ. Στο Μέρος IV, πραγματοποιήθηκε ολοκληρωμένη δομική και λειτουργική ανάλυση του κλωνοτυπικού ΒκΥ στο ΣΛΟΖ. Οι ΣΛΟΖ ΒκΥ βρέθηκε να είναι αυτο/πολυαντιδραστικοί, αναγνωρίζοντας ένα ευρύ φάσμα αυτοαντιγόνων και μικροβιακών στόχων ανεξαρτήτως γονιδίου ή βαθμού ΣΥΜ. Ιδιαίτερα αξιοσημείωτος ήταν ο ρόλος του αλληλομόρφου IGHV1-2*04, το οποίο κωδικοποιεί ένα μοναδικό κατάλοιπο τρυπτοφάνης στη θέση 75 της VH FR3 (W75) κρίσιμο για τη δέσμευση αντιγόνων και την ομότυπη αλληλεπίδραση του ΒκΥ. Πειράματα μεταλλαξιγένεσης έδειξαν ότι το W75 αναδιαμορφώνει την (αυτο)αντιγονική αντιδραστικότητα, ενώ δομικές μελέτες αποκάλυψαν συντηρημένες ομότυπες αλληλεπιδράσεις του ΒκΥ. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η παθογένεση του ΣΛΟΖ πιθανώς τροφοδοτείται από έναν συνδυασμό χρόνιας σηματοδότησης του ΒκΥ εξαρτώμενης από αντιγόνο και αυτόνομης σηματοδότησης, προσφέροντας πληροφορίες με πιθανή θεραπευτική σημασία. Συνολικά, η εργασία υπογραμμίζει ότι η φυσική ιστορία των κακοηθειών των ώριμων Β λεμφοκυττάρων δεν μπορεί να διαχωριστεί από τη βιολογία του ΒκΥ. Η αντιγονική επιλογή, η κλωνική εξέλιξη και η αυτόνομη σηματοδότηση συνιστούν μία αλληλένδετη τριάδα που καθορίζει την πορεία από την ΜΒΛ έως τα ώριμα λεμφώματα και τις λευχαιμίες. Συμβάλλοντας στην αποσαφήνιση της μοριακής και δομικής βάσης αυτών των διαδικασιών, η παρούσα διατριβή συμβάλλει στην κατανόηση της παθογένεσης των νόσων, ενώ ταυτόχρονα υποδεικνύει νέες προοπτικές για στοχευτικές θεραπευτικές παρεμβάσεις.