Μηχανισμοί αλληλεπίδρασης αιμοπεταλίων-λευκοκυττάρων: ρόλος στην αθηροθρόμβωση

Abstract

Background: Neutrophil leukocytes are among the first lines of host defense in the presence of pathogens, as well as in sterile inflammatory conditions. During their activation, neutrophils produce neutrophil extracellular traps (NETs), i.e. genetic material which is enriched in proteins that derive from all types of neutrophil granules. Upon their release, NETs entrap and eliminate pathogens. However, during the last 20 years, a vast number of papers has demonstrated that NETs are implicated in the pathophysiology of various diseases, such as, but not limited to, autoimmune disorders, cancer, diabetes mellitus, as well as atherosclerosis and thrombosis. Among the factors that trigger NET formation are platelets, the role of which in the pathophysiology of atherothrombosis has been extensively studied during the last decades. Despite the fact that in the scientific literature the cooperative action of platelets, neutrophils and NETs, regarding the pathophysiological mechanisms of atherothrombosis, has been described up to a point, the interaction between them has not yet been fully deciphered. Aim: The aim of the present Doctoral Thesis was to elucidate in greater detail the molecular mechanisms regarding the interaction between platelets and leukocytes, with emphasis given to neutrophils, in the context of the pathophysiology of atherothrombosis. Materials and Methods: In the context of the present dissertation, we isolated human neutrophils from whole blood of healthy volunteers, which were subsequently activated in the presence or absence of various stimuli, such as activated platelets, PMPs, as well as traditional neutrophil agonists. Simultaneously, the activation of neutrophils was inhibited in the presence or absence of inhibitory factors, such as ticagrelor. Furthermore, the role of neutrophil CD162 and TLR-4 receptors, in the context of platelet- and PMP-induced neutrophil activation, was investigated. The Boyden chamber chemotaxis assay was also performed, as was performed immunofluorescence staining for the semi-quantification and visualization of neutrophils and NETs, while for the quantification of neutrophils and NETs we performed ELISA for the determination of DNA-myeloperoxidase complexes. In other experiments, in reverse, NETs were shown to activate platelets, while this activation was inhibited in the presence of ticagrelor. In these experiments, washed platelets were prepared and light transmittance aggregometry was subsequently performed. Results: The agonist, fMLP, induced the robust chemotaxis of neutrophils. Furthermore, activated platelets induced the robust chemotaxis of neutrophils, either when pre-activated in the aggregometer or when activated in situ. Ticagrelor inhibited neutrophil chemotaxis, both induced by fMLP or activated platelets, in a statistically significant manner. Among all agonists tested, only PMA and AA induced a potent NETosis. Moreover, activated platelets induced a potent NETosis, either when pre-activated in the aggregometer or activated in situ. Ticagrelor inhibited activated platelet-induced NETosis in a statistically significant manner, although it did not prevent NETosis induced by PMA or AA. PMPs induced a potent NETosis, which was inhibited by ticagrelor in a statistically significant manner. When used as antagonists, the antibodies against CD162 and TLR-4 inhibited platelet- and PMP-induced NET formation in a statistically significant manner. In all the above experiments, neutrophil viability and sample purity were above 95%. Discussion: The above results point towards a central role of PMPs and platelets in the pathophysiology of atherothrombosis, since they mediate the activation of neutrophils and the subsequent NETosis, through the neutrophil receptors, CD162 and TLR-4.

Θεωρητικό Υπόβαθρο: Τα ουδετερόφιλα λευκοκύτταρα συνιστούν αναπόσπαστο τμήμα της γενικής ανοσίας, στρατολογούμενα κατά την παρουσία παθογόνων μικροοργανισμών, αλλά και σε συνθήκες ασηπτικής φλεγμονής. Τα ουδετερόφιλα, κατά την ενεργοποίησή τους, παράγουν ουδετεροφιλικά δίκτυα χρωματίνης (neutrophil extracellular traps, NETs), δηλαδή γενετικό υλικό εμπλουτισμένο σε πρωτεΐνες των ουδετεροφίλων, το οποίο απελευθερώνεται, παγιδεύει και εξουδετερώνει τα παθογόνα. Παρά το γεγονός αυτό, τα τελευταία 20 χρόνια, σωρεία μελετών έχουν παράσχει ισχυρές ενδείξεις ότι τα NETs συμβάλλουν στην παθοφυσιολογία πληθώρας νόσων, όπως είναι τα αυτοάνοσα νοσήματα, ο καρκίνος, ο σακχαρώδης διαβήτης, αλλά και η αθηροσκλήρωση και η θρόμβωση. Ανάμεσα στους παράγοντες που πυροδοτούν την παραγωγή των NETs είναι και τα αιμοπετάλια, των οποίων ο ρόλος στην αθηροθρόμβωση είναι γνωστός εδώ και δεκαετίες. Αν και στη διεθνή βιβλιογραφία έχει περιγραφεί μέχρι σήμερα, ως ένα βαθμό, η συνεργατική δράση των αιμοπεταλίων, των ουδετεροφίλων και των NETs ως προς τους παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς της αθηροθρόμβωσης, η σχέση αυτή δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως. Σκοπός: Σκοπός της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής ήταν η διαλεύκανση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν την αλληλεπίδραση των αιμοπεταλίων και των λυκοκυττάρων, με έμφαση στα ουδετερόφιλα, στο πλαίσιο της παθοφυσιολογίας της αθηροθρόμβωσης. Υλικά και Μέθοδοι: Στο πλαίσιο της παρούσας Διατριβής, πραγματοποιήθηκε απομόνωση ανθρώπινων ουδετεροφίλων από ολικό αίμα υγειών εθελοντών, τα οποία ενεργοποιήθηκαν παρουσία ή απουσία διαφόρων διεγερτικών παραγόντων, όπως είναι τα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια, τα PMPs, καθώς και κλασσικοί αγωνιστές των ουδετεροφίλων. Ταυτόχρονα, η ενεργοποίηση των ουδετεροφίλων ανεστάλη παρουσία ή απουσία ανασταλτικών παραγόντων όπως είναι η τικαγρελόρη. Διερευνήθηκε, ακόμη, ο ρόλος των υποδοχέων CD162 και TLR-4 των ουδετεροφίλων, στην επαγόμενη από αιμοπετάλια και PMPs ενεργοποίηση των ουδετεροφίλων. Πραγματοποιήθηκε δοκιμασία χημειοτακτισμού με το θάλαμο Boyden, ανοσοφθορισμός για τον ημιποσοτικό προσδιορισμό των NETs και την οπτικοποίησή τους, ενώ ο ποσοτικός προσδιορισμός τους πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ELISA έναντι της συζευγμένης στο DNA μυελοϋπεροξειδάσης των ουδετεροφίλων και των NETs. Σε άλλα πειράματα, αντίστροφα, τα NETs ενεργοποίησαν τα αιμοπετάλια, και η ενεργοποίηση αυτή ανεστάλη παρουσία τικαγρελόρης. Στα πειράματα αυτά, παρασκευάστηκαν πλυμένα αιμοπετάλια και πραγματοποιήθηκε συσσωρευομετρία οπτικής διαπερατότητας. Αποτελέσματα: Το fMLP προκάλεσε ισχυρή επαγωγή του χημειοτακτισμού των ουδετεροφίλων. Ακόμη, τα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια προκάλεσαν ισχυρή επαγωγή του χημειοτακτισμού των ουδετεροφίλων, είτε αυτά είχαν προενεργοποιηθεί εντός του συσσωρευομέτρου είτε είχαν ενεργοποιηθεί in situ. Η τικαγρελόρη ανέστειλε στατιστικά σημαντικά τόσο τον επαγόμενο από το fMLP χημειοτακτισμό των ουδετεροφίλων όσο και τον επαγόμενο από τα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια χημειοτακτισμό των ουδετεροφίλων, είτε εντός του συσσωρευομέτρου είτε in situ. Μεταξύ όλων των αγωνιστών που δοκιμάσθηκαν, μόνο το PMA και το AA προκάλεσαν ισχυρή επαγωγή των NETs. Επιπλέον, τα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια προκάλεσαν ισχυρή επαγωγή των NETs, είτε αυτά είχαν προενεργοποιηθεί εντός του συσσωρευομέτρου είτε είχαν ενεργοποιηθεί in situ. Η τικαγρελόρη ανέστειλε στατιστικά σημαντικά την επαγόμενη από τα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια νέτωση, είτε εντός του συσσωρευομέτρου είτε in situ, αλλά δεν είχε επίδραση στην επαγόμενη από το PMA ή το AA νέτωση. Τα PMPs προκάλεσαν ισχυρή επαγωγή των NETs, και η νέτωση αυτή επίσης ανεστάλη στατιστικά σημαντικά από την τικαγρελόρη. Η χρήση των αντισωμάτων κατά των υποδοχέων CD162 και TLR-4 προκάλεσε εξασθένιση της επαγόμενης από ενεργοποιημένα αιμοπετάλια και PMPs, νέτωσης. Τέλος, τα NETs προκάλεσαν στατιστικά σημαντική συσσώρευση των αιμοπεταλίων, η οποία ανεστάλη στατιστικά σημαντικά από την τικαγρελόρη. Σε όλα τα παραπάνω πειράματα, η βιωσιμότητα των ουδετεροφίλων, καθώς και η καθαρότητα του δείγματος ήταν > 95%. Συμπεράσματα: Τα παραπάνω αποτελέσματα καταδεικνύουν έναν κεντρικό ρόλο των αιμοπεταλίων και των PMPs στην παθοφυσιολογία της αθηροθρόμβωσης, καθώς διαμεσολαβούν την ενεργοποίηση των ουδετεροφίλων και τη νέτωση διαμέσου των υποδοχέων CD162 και TLR-4 των ουδετεροφίλων.