Characterization of the gingival phenotype at the clinical, cellular and molecular level

Abstract

Distinction between gingival phenotypes is based on morphological differences in gingival tissues, which have been associated with divergent responses under inflammatory and traumatic conditions. However, the histological foundation of these differences has been only minimally explored. The aim of the present thesis was to investigate potential histological variations between clinically determined gingival phenotypes at the morphometric, cellular, and molecular levels. A further objective was to examine possible correlations between the key components of the gingival phenotype—namely, gingival thickness (GT) and keratinized tissue width (KT)—and histological features of the gingival tissues. For this purpose, forty-five periodontally healthy volunteers were classified into two phenotype groups (thin and thick) based on the transparency of the free gingiva in the region of the maxillary central incisors. Clinical measurements included GT, assessed with an ultrasound device (PIROP, Echo-Son, Poland), and KT evaluation. Gingival biopsies were harvested from the buccal region of the maxillary central incisors, extending 2 mm on either side of the mucogingival junction. Tissue specimens were stained with hematoxylin–eosin and Weigert–van Gieson for elastic fibers. Immunohistochemical staining targeted cellular markers (CD68, Ki-67, SMA, TGF-β1) and extracellular matrix components (collagen type I, collagen type III, hyaluronic acid). Morphometric measurements (epithelial and connective tissue thickness, papilla height and density), cell counts, and semi-quantitative assessment of staining intensity were performed using digital image analysis software (QuPath). Statistical analyses were carried out with SPSS 27. The findings demonstrated that the difference in gingival thickness between thin and thick phenotypes was attributable mostly to variations in connective tissue thickness (r = 0.917), whereas epithelial thickness showed only a moderate correlation with overall thickness (r = 0.630). No significant differences in histomorphometric parameters or extracellular matrix composition were observed between phenotypes. However, the thin phenotype displayed significantly higher densities of CD68-, Ki-67-, and SMA-positive cells in the connective tissue papillae (p = 0.064, p = 0.05, and p = 0.026, respectively), along with a higher proportion of CD68-positive cells in the superficial connective tissue layer (p = 0.027). Comparable correlations between cell counts and gingival thickness were also detected at the level of the connective tissue papillae. A noteworthy negative correlation was identified between GT and TGF-β1-positive cells in the superficial connective tissue (p = 0.005). Furthermore, GT was positively associated with papilla length (p < 0.001) and negatively with papilla density (p = 0.036). In contrast, KT showed moderate correlation only with epithelial parameters, such as epithelial thickness (p = 0.020) and papilla length (p = 0.036), while also demonstrating a moderate positive association with the total cell count in the subepithelial connective tissue (p = 0.045). Semi-quantitative analysis of staining intensity revealed trends toward a negative correlation between collagen type I expression and GT (p = 0.026), as well as between hyaluronic acid intensity and both GT (p = 0.052) and KT (p = 0.048). These results support the hypothesis that the thin gingival phenotype may be metabolically and immunologically more active, likely due to the increased presence of macrophages (CD68-positive), proliferating cells (Ki-67-positive), and vascular elements (SMA-positive). Moreover, the connective tissue papillae emerged as the anatomical region exhibiting the most pronounced histological differences between phenotypes, both in terms of morphology and cellular composition—an observation with potential functional and clinical implications. In conclusion, this study underscores the need for a multifactorial evaluation of the gingival phenotype and highlights the complex yet consistent relationships linking tissue morphology, cellular composition, and phenotypic characteristics of the gingiva.

Ο προδιορισμός των ουλικών φαινοτύπων βασίζεται σε μορφολογικές διαφορές των ούλων, οι οποίες έχουν συσχετιστεί με τη διαφορετική συμπεριφορά τους σε καταστάσεις φλεγμονής και τραύματος. Ωστόσο, η ιστολογική βάση αυτών των διαφορών έχει διερευνηθεί ελάχιστα έως σήμερα. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση πιθανών ιστολογικών διαφορών μεταξύ των κλινικά προσδιοριζόμενων ουλικών φαινοτύπων, τόσο σε μορφομετρικό όσο και σε κυτταρικό και μοριακό επίπεδο. Παράλληλα, διερευνήθηκε η πιθανή συσχέτιση των επιμέρους χαρακτηριστικών του ουλικού φαινοτύπου, δηλαδή του πάχους των ούλων και του εύρους των κερατινοποιημένων ιστών, με τα ιστολογικά χαρακτηριστικά των ουλικών ιστών. Για τον σκοπό αυτό, σαράντα πέντε περιοδοντικώς υγιείς εθελοντές ταξινομήθηκαν σε δύο ομάδες φαινοτύπου – λεπτό και παχύ – βάσει της μεθόδου εκτίμησης της διαφάνειας της ελεύθερης ουλοπαρειακής περιοχής των άνω κεντρικών τομέων. Σε κάθε συμμετέχοντα πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις του πάχους των ούλων με υπερηχογραφική συσκευή (PIROP, Echo-Son, Poland), καθώς και μέτρηση του εύρους των κερατινοποιημένων ιστών. Στη συνέχεια, ελήφθησαν βιοψίες από την παρειακή επιφάνεια των άνω κεντρικών τομέων που εκτείνονταν δύο χιλιοστά εκατέρωθεν της ουλοβλεννογόνιας ένωσης. Οι ιστολογικές τομές χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη-εωσίνη και με χρώση Weigert-van Gieson για την ανάδειξη των ελαστικών ινών. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε ανοσοϊστοχημική χρώση με αντισώματα που στόχευαν κυτταρικούς δείκτες (CD68, Ki-67, SMA, TGF-β1) και στοιχεία της εξωκυττάριας ουσίας (κολλαγόνο Ι, κολλαγόνο ΙΙΙ, υαλουρονικό οξύ). Με τη χρήση λογισμικού ψηφιακής ανάλυσης εικόνας (QuPath), καταγράφηκαν μορφομετρικές μετρήσεις (πάχος επιθηλίου και συνδετικού ιστού, ύψος και πυκνότητα θηλών του συνδετικού ιστού), κυτταρικές πυκνότητες και ημιποσοτικές τιμές της έντασης των ανοσοϊστοχημικών χρώσεων. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με το πρόγραμμα SPSS 27. Τα αποτελέσματα της μελέτης κατέδειξαν ότι η διαφορά στο πάχος των ούλων μεταξύ λεπτού και παχέος φαινοτύπου αποδίδεται σχεδόν αποκλειστικά στο διαφορετικό πάχος του συνδετικού ιστού (r=0.917), ενώ το επιθηλιακό πάχος εμφάνισε μόνο μέτρια συσχέτιση με το συνολικό πάχος (r=0.630). Οι φαινότυποι δεν εμφάνισαν σημαντικές ιστομορφομετρικές διαφορές ή διαφορές στη σύσταση της εξωκυττάριας ουσίας, ωστόσο ο λεπτός φαινότυπος παρουσίασε αυξημένη πυκνότητα CD68-, Ki-67- και SMA-θετικών κυττάρων στις θηλές του συνδετικού ιστού (p=0.064, p=0.05 και p=0.026, αντίστοιχα). Επίσης παρουσίασε αυξημένη ποσοστιαία περιεκτικότητα των CD68-θετικών κυττάρων στην επιφανειακή στιβάδα του συνδετικού ιστού (p=0.027). Αντίστοιχες συσχετίσεις των κυτταρικών αριθμών διαπιστώθηκαν με το πάχος των ούλων στο επίπεδο των θηλών του συνδετικού ιστού. Σημαντική παρατήρηση αποτελεί η αρνητική συσχέτιση του πάχους των ούλων με τα TGF-β1 θετικά κύτταρα στην επιφανειακή ζώνη του συνδετικού ιστού (p=0.005). Το πάχος των ούλων παρουσίασε θετική συσχέτιση με το μήκος των θηλών του συνδετικού ιστού (p<0.001) και αρνητική συσχέτιση με την πυκνότητά τους (p=0.036). Αντίθετα, το εύρος των κερατινοποιημένων ιστών εμφάνισε μέτρια συσχέτιση μόνο με επιθηλιακές παραμέτρους, δηλαδή με το πάχος του επιθηλίου (p=0.020) και με το μήκος των θηλών του συνδετικού ιστού (p=0.036), ενώ όσον αφορά τους κυτταρικούς αριθμούς το εύρος των κερατινοποιημένων ιστών εμφάνισε μέτρια θετική συσχέτιση με τον συνολικό αριθμό κυττάρων στον υποεπιθηλιακό συνδετικό ιστό (p=0.045). Η αξιολόγηση της έντασης της ανοσοϊστοχημικής χρώσης των μορίων της εξωκυττάριας ουσίας έδειξε τάσεις αρνητικής συσχέτισης της έντασης χρώσης του κολλαγόνου τύπου Ι με το πάχος των ούλων (p=0.026) και του υαλουρονικού οξέος με το πάχος των ούλων (p=0.052) και το εύρος των κερατινοποιημένων ιστών (p=0.048). Τα δεδομένα της διατριβής ενισχύουν την υπόθεση ότι ο λεπτός ουλικός φαινότυπος είναι μεταβολικά και ανοσολογικά πιο ενεργός, ενδεχομένως εξαιτίας της αυξημένης παρουσίας μακροφάγων (CD68-θετικά κύτταρα), πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (Ki-67-θετικά κύτταρα) και στοιχείων αγγείωσης (SMA-θετικά κύτταρα). Επιπλέον, οι θηλές του συνδετικού ιστού αναδείχθηκαν ως η περιοχή με τις μεγαλύτερες ιστολογικές διαφορές μεταξύ των φαινοτύπων, τόσο σε επίπεδο μορφολογίας όσο και κυτταρικής σύνθεσης, γεγονός που μπορεί να έχει λειτουργικές και κλινικές προεκτάσεις. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της μελέτης ενισχύουν τη σημασία της πολυπαραγοντικής αξιολόγησης του ουλικού φαινοτύπου και αποκαλύπτουν πολύπλοκες, αλλά σαφείς σχέσεις μεταξύ της μορφολογίας, της κυτταρικής σύνθεσης και των κλινικών χαρακτηριστικών των ουλικών ιστών.