The interplay of DNA damage response and immune system network in lung cancer therapy

Abstract

Lung cancer remains one of the most prevalent malignancies globally, characterized by persistently high mortality rates. Its pathogenesis has been strongly linked to exposure to DNA-damaging agents, resulting in genomic instability and elevated mutational burden. Standard-of-care treatment typically involves platinum-based chemotherapy and immunotherapy, particularly immune checkpoint inhibitors (ICIs). Central to the cellular response to genotoxic stress is the DNA damage response (DDR) network, a complex system responsible for detecting and repairing DNA lesions or initiating apoptosis. Disruption of DDR mechanisms contributes to genomic instability, driving tumorigenesis, and also exerts profound effects on immune regulation—features that underscore its therapeutic relevance. Moreover, intracellular redox homeostasis, often assessed via the reduced/oxidized glutathione ratio (GSH/GSSG), is critical for maintaining cell viability and modulating signaling cascades, and is closely linked to the formation of DNA damage. This study aimed to investigate the interplay between DDR and the immune system in the context of the anti-tumor response in lung cancer. DDR-related parameters and redox status were assessed in two lung cancer cell lines (A549, H1299), two normal fibroblast lines (WS1, 1BR3hT), and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from 20 healthy donors and 32 lung cancer patients at baseline—comprising 17 responders and 15 non-responders to subsequent platinum-based chemotherapy. Compared to normal fibroblasts, lung cancer cell lines exhibited significantly higher baseline DNA damage, increased apurinic/apyrimidinic (AP) site formation, decreased GSH/GSSG ratios, impaired nucleotide excision repair (NER), and enhanced interstrand cross-link (ICL) repair efficiency (all p < 0.05). Similarly, PBMCs from patients with lung cancer demonstrated reduced redox capacity, increased DNA damage, diminished DNA repair functionality, and attenuated apoptotic responses relative to healthy controls (all p < 0.001). Notably, responder patients displayed higher AP site burden, lower GSH/GSSG ratios, reduced NER and ICL repair capacity, and increased apoptosis compared to non-responders (all p < 0.01). These findings suggest that DDR and redox parameters may serve as non-invasive biomarkers to predict therapeutic responsiveness to platinum-based regimens.Among the key regulators of DDR are the kinases ATR (ataxia telangiectasia and Rad3-related) and ATM (ataxia-telangiectasia mutated). Emerging evidence indicates that ATR inhibition induces synthetic lethality in ATM-deficient tumors and may potentiate anti-tumor immunity by enhancing tumor mutational burden and neoantigen presentation. Additionally, ATR inhibition promotes cytosolic DNA accumulation, activating the cGAS–STING pathway and type I interferon signaling. Thus, targeting ATR represents a promising therapeutic approach, either as monotherapy or in combination with genotoxic agents and/or immunomodulatory therapies.We evaluated the efficacy of the ATR inhibitor AZD6738 both in vitro and in vivo. In lung cancer cell lines (A549, H1299) and the murine line LLC, combination treatment with AZD6738 and cisplatin significantly increased DNA damage, AP site formation, and oxidative stress. H1299 cells (p53-deficient) were particularly sensitive to ATR inhibition followed by UV-C irradiation, demonstrating pronounced genomic stress and redox imbalance. These results underscore the potential of ATR inhibition as a therapeutic strategy, contingent on tumor genotype and optimized dosing regimens. Specifically, tumors harboring ATM mutations may derive greater benefit from ATR-targeted therapies in combination with chemotherapy or immunotherapy.To explore this approach in vivo, a syngeneic heterotopic lung cancer model was established via subcutaneous implantation of LLC cells into C57BL/6 mice. Initial experiments assessing the combination of cisplatin with prolonged AZD6738 treatment revealed no significant difference in tumor volume, although a notable increase in CD8⁺ T cell infiltration was observed following ATR inhibition. Subsequently, the therapeutic impact of integrating AZD6738 with cisplatin and the immune checkpoint inhibitor αPD1 was evaluated. Using a short-course ATRi regimen alongside chemotherapy, followed by one or two cycles of αPD1 immunotherapy, we found that the triple combination conferred the greatest tumor suppression. Tumor growth arrest was observed by day 11 but resumed following treatment cessation or upon repeated αPD1 dosing. These findings suggest that DNA damage induced by combined chemotherapy and ATR inhibition may transiently enhance neoantigen exposure, promote immunogenic cell death, and activate the cGAS/STING pathway -collectively fostering a potent yet time-limited anti-tumor immune response. Tumor progression after treatment withdrawal may reflect declining immunostimulatory signaling or suboptimal T cell priming/exhaustion during αPD1 exposure.Notably, extended αPD1 therapy increased total CD3⁺ T cell infiltration without a concomitant rise in CD4⁺ or CD8⁺ subsets, suggesting enrichment of double-negative (DN) T cells—an unconventional population associated with immune modulation. Indeed, DN T cells constituted a high proportion of tumor-infiltrating T cells (~30–80% of CD3⁺), but only a minor subset in spleens (~5–12%). AZD6738 and repeated αPD1 dosing markedly expanded DN T cells within tumors (up to ~60–80%), indicating a tumor-specific enrichment potentially driven by treatment-induced immune modulation. These observations raise the possibility that DN T cells play an active role in shaping the immune response within the tumor microenvironment under specific therapeutic conditions.In conclusion, while immune checkpoint blockade facilitates tumor infiltration by T cells, optimizing the immunostimulatory microenvironment is crucial to sustaining effective anti-tumor responses. Our findings provide insights into DDR-immune system interactions and support the rationale for combinatorial regimens involving ATR inhibitors, chemotherapy, and ICIs—tailored to tumor-specific molecular profiles and treatment kinetics—to maximize clinical benefit.

Ο καρκίνος του πνεύμονα παραμένει ένα από τα πιο συχνά διαγνωσμένα κακοήθη νεοπλάσματα παγκοσμίως, με σταθερά υψηλά ποσοστά θνησιμότητας. Η παθογένεσή του σχετίζεται άμεσα με την έκθεση σε παράγοντες που προκαλούν βλάβες στο DNA, οδηγώντας σε γονιδιωματική αστάθεια και αυξημένο μεταλλαξιογόνο φορτίο. Η συνήθης θεραπευτική προσέγγιση περιλαμβάνει χημειοθεραπεία βασισμένη σε πλατίνη και ανοσοθεραπεία με αναστολείς σημείων ελέγχου του ανοσοποιητικού (ICIs). Ο μηχανισμός απόκρισης στη βλάβη του DNA (DNA Damage Response, DDR) αποτελεί ένα περίπλοκο δίκτυο σηματοδοτικών μονοπατιών που εντοπίζουν και επιδιορθώνουν βλάβες στο DNA ή επάγουν απόπτωση. Η διαταραχή της λειτουργίας του DDR συμβάλλει στη γονιδιωματική αστάθεια, προάγοντας την καρκινογένεση, ενώ επηρεάζει και το ανοσοποιητικό σύστημα, γεγονός που προσδίδει σημαντική θεραπευτική σημασία. Παράλληλα, η ενδοκυττάρια οξειδοαναγωγική ισορροπία, εκφραζόμενη ως λόγος GSH/GSSG, είναι κρίσιμη για τη διατήρηση της κυτταρικής βιωσιμότητας και τη ρύθμιση σηματοδοτικών μονοπατιών, ενώ σχετίζεται με τη δημιουργία βλαβών στο DNA. Η παρούσα μελέτη είχε στόχο να διερευνήσει την αλληλεπίδραση μεταξύ του DDR και του ανοσοποιητικού συστήματος στη θεραπευτική απόκριση του καρκίνου του πνεύμονα.Οι δείκτες DDR και η οξειδοαναγωγική κατάσταση μετρήθηκαν σε δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα (A549, H1299), δύο φυσιολογικές σειρές ινοβλαστών (WS1, 1BR3hT) και σε περιφερικά μονοπύρηνα κύτταρα αίματος (PBMCs) από 20 υγιείς δότες και 32 ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα (17 ανταποκρινόμενοι και 15 μη ανταποκρινόμενοι σε επακόλουθη χημειοθεραπεία με βάση την πλατίνη). Οι καρκινικές κυτταρικές σειρές παρουσίασαν υψηλότερα επίπεδα ενδογενούς βλάβης DNA, αυξημένα απουρινικά/απυριμιδινικά σημεία (AP sites), χαμηλότερους λόγους GSH/GSSG, μειωμένη ικανότητα επιδιόρθωσης μέσω NER και αυξημένη ικανότητα επιδιόρθωσης διακλαδικών δεσμών (ICLs), συγκριτικά με τα φυσιολογικά κύτταρα (p < 0,05). Αντίστοιχα, τα PBMCs των ασθενών παρουσίασαν χαμηλότερους λόγους GSH/GSSG, περισσότερα AP sites, μειωμένη επιδιόρθωση DNA και χαμηλότερα ποσοστά απόπτωσης συγκριτικά με τους υγιείς δότες (p < 0,001). Επιπλέον, τα PBMCs των ανταποκρινόμενων ασθενών εμφάνιζαν εντονότερη βλάβη DNA, χαμηλότερους λόγους GSH/GSSG, μειωμένη ικανότητα επιδιόρθωσης και αυξημένη απόπτωση σε σχέση με τους μη ανταποκρινόμενους (p < 0,01). Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι οι δείκτες DDR και οξειδοαναγωγικής ισορροπίας ενδέχεται να χρησιμεύσουν ως μη επεμβατικοί βιοδείκτες πρόγνωσης της ανταπόκρισης στη χημειοθεραπεία με βάση την πλατίνη. Κρίσιμοι ρυθμιστές του DDR αποτελούν οι κινάσες ATR (Ataxia Telangiectasia and Rad3-related) και ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated). Σύγχρονα δεδομένα έχουν δείξει ότι η αναστολή της ATR μπορεί να προκαλέσει συνεργατική θανατηφόρο δράση (synthetic lethality) σε νεοπλάσματα με έλλειψη ATM, ενώ ταυτόχρονα ενισχύει την ανοσολογική απόκριση αυξάνοντας το μεταλλαξογόνο φορτίο, την παρουσία νεοαντιγόνων και ενεργοποιώντας την οδό cGAS–STING και την παραγωγή ιντερφερονών τύπου Ι. Συνεπώς, η στόχευση της ATR αποτελεί πολλά υποσχόμενη θεραπευτική στρατηγική, είτε ως μονοθεραπεία είτε σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία ή/και ανοσοθεραπεία. Αξιολογήθηκε η αποτελεσματικότητα του νεότερου αναστολέα ATR, AZD6738, τόσο in vitro όσο και in vivo. Στις κυτταρικές σειρές A549, H1299 και LLC, ο συνδυασμός του AZD6738 με σισπλατίνη ενίσχυσε σημαντικά τη βλάβη του DNA, τα AP sites και τη μείωση του λόγου GSH/GSSG. Η κυτταρική σειρά H1299 (έλλειψη p53) εμφάνισε ιδιαίτερη ευαισθησία στην αναστολή ATR ακολουθούμενη από UVC ακτινοβολία, με έντονη συσσώρευση βλάβης DNA και οξειδωτικού στρες. Τα ευρήματα υποστηρίζουν την ATR ως θεραπευτικό στόχο, του οποίου η αποτελεσματικότητα εξαρτάται από το γονιδιακό υπόβαθρο του όγκου και το θεραπευτικό σχήμα. Συγκεκριμένα, ασθενείς με μεταλλάξεις στο ATM ενδέχεται να ωφεληθούν από εξατομικευμένα θεραπευτικά πρωτόκολλα που συνδυάζουν ATR αναστολείς με χημειοθεραπεία ή/και ανοσοθεραπεία. Για την in vivo αξιολόγηση, αναπτύχθηκε ένα συγγενές ετεροτοπικό μοντέλο καρκίνου του πνεύμονα με υποδόρια έγχυση κυττάρων LLC σε ποντικούς C57BL/6. Στην πρώτη φάση, εξετάστηκε ο συνδυασμός σισπλατίνης και παρατεταμένης χορήγησης AZD6738, χωρίς σημαντικές διαφορές στον ρυθμό ανάπτυξης των όγκων. Ωστόσο, παρατηρήθηκε αύξηση της διήθησης των CD8⁺ Τ κυττάρων στους όγκους μετά από θεραπεία με AZD6738.Στη συνέχεια, μελετήθηκε η ενίσχυση της αποτελεσματικότητας της ανοσοθεραπείας μέσω συνδυασμού ATR αναστολής, χημειοθεραπείας και αναστολέα σημείου ελέγχου αPD1. Η χορήγηση βραχείας διάρκειας ATR αναστολής σε συνδυασμό με σισπλατίνη, ακολουθούμενη από μία ή δύο δόσεις αPD1, ανέδειξε ότι η τριπλή θεραπεία επιφέρει τη μεγαλύτερη μείωση όγκου. Παρατηρήθηκε αναστολή της ανάπτυξης των όγκων την 11η ημέρα, η οποία επανήλθε μετά τη διακοπή της θεραπείας ή τη δεύτερη δόση αPD1. Προτείνεται ότι η ταυτόχρονη χημειοθεραπεία και αναστολή ATR προκαλεί παροδική αύξηση της ανοσογονικότητας μέσω έκθεσης νεοαντιγόνων, επαγωγής ανοσογονικού κυτταρικού θανάτου και ενεργοποίησης της οδού cGAS/STING. Ωστόσο, μετά τη διακοπή της θεραπείας, η μείωση των σηματοδοτικών μορίων (όπως οι ιντερφερόνες τύπου Ι) ενδέχεται να οδηγεί στην επαναφορά ενός ανοσοκατασταλτικού μικροπεριβάλλοντος ή στην εξάντληση των Τ κυττάρων, περιορίζοντας την αντικαρκινική ανοσοεπιτήρηση. Η παρατεταμένη χορήγηση αPD1 οδήγησε σε αύξηση των CD3⁺ Τ κυττάρων εντός των όγκων, χωρίς ωστόσο να υπάρξει αύξηση των CD4⁺ ή CD8⁺ υποπληθυσμών, υποδεικνύοντας την παρουσία διπλά αρνητικών (DN) Τ κυττάρων – ενός μη συμβατικού πληθυσμού με πιθανή ανοσοκατασταλτική δράση. Τα DN Τ κύτταρα αποτέλεσαν υψηλό ποσοστό των CD3⁺ κυττάρων εντός των όγκων (~30–80%), ενώ στον σπλήνα ανέρχονταν μόνο σε χαμηλά ποσοστά (~5–12%). Η θεραπεία με AZD6738 και αPD1 (x2) αύξησε σημαντικά την παρουσία DN κυττάρων, γεγονός που υποδηλώνει ειδική ενδο-ογκική αύξηση που πιθανώς ελέγχεται από ανοσοτροποποιητικά ερεθίσματα της θεραπείας. Συμπερασματικά, παρότι η ανοσοθεραπεία διευκολύνει τη διείσδυση Τ κυττάρων στον όγκο, η ενίσχυση του ανοσοδιεγερτικού μικροπεριβάλλοντος παραμένει κρίσιμη για τη διατήρηση μιας ισχυρής και διαρκούς αντικαρκινικής ανοσοαπόκρισης. Τα ευρήματά μας αναδεικνύουν τη σημασία της αλληλεπίδρασης DDR–ανοσοποιητικού και υποστηρίζουν τη στρατηγική χρήσης συνδυαστικών σχημάτων με αναστολείς ATR, χημειοθεραπεία και ανοσοθεραπεία, προσαρμοσμένων στο μοριακό προφίλ του όγκου και στο κατάλληλο δοσολογικό σχήμα.