Influences of gut microbiota, hypoxia and F8-deficiency on plasmatic von Willebrand factor levels and integrin αIIbβ3 mediated platelet function

Abstract

Von Willebrand factor (VWF) is a plasma glycoprotein, which in addition to its role in hemostasis, participates in angiogenesis and immune responses. Its contribution to hemostasis is multifunctional. Most importantly, it serves as an adhesive matrix for platelets under high shear forces, through the platelet GPIb/IX/V receptor complex (or GPIb alpha), as a ligand for the platelet integrin αIIbβ3, and as a carrier molecule for coagulation factor VIII (FVIII), protecting it from proteolytic degradation. This thesis investigates the role of VWF expression and the integrin-dependent platelet functionsand is divided into three parts. First, using a mouse model of hemophilia A, we examined the effect of FVIII deficiency on VWF plasma levels and its implication in the development of a low-grade hepatic inflammatory phenotype. Interestingly, F8-deficient mice showed increased VWF plasma levels that were not associated with increased VWF synthesis or reduced clearance, but with elevated expression of inflammatory genes in the liver. Supplementation of human FVIII reduced VWF plasma levels to normal. Taking advantage of germ-free (GF) mouse isolator technology, we investigated the impact of gut microbiota on VWF expression in a model of platelet deposition to the ligation-injured carotid artery. GF mice showed a reduction on VWF plasma levels and hepatic synthesis and reduced integrin-dependent platelet deposition on the ligationinjured carotid artery or on matrix coated coverslips in comparison to their conventionally raised (CONV-R) counterparts. We demonstrate for the first time that gut microbiota release microbial patterns inducing VWF synthesis via Toll-like receptor-2 (TLR2) signaling in the hepatic endothelium. In the third part, we explored the αIIbβ3 mediated human platelet function under hypoxia. The incubation of isolated human washed platelets under low oxygen levels led to impaired agonist-induced integrin αIIbβ3 activation and platelet aggregation. This effect was fast, reversible, and was not observed in platelet-rich plasma. In vitro adhesion studies showed that hypoxia specifically inhibits the function of the αIIb subunit of the αIIbβ3 integrin. Collectively, this thesis describes how influences, such as the microbial colonization status of the host or the exposure to hypoxia can modulate the interaction of platelet integrins with subendothelial matrix proteins, thus affecting pro-thrombotic platelet function and hepatic low-grade inflammation.

Ο παράγοντας von Willebrand (VWF) είναι μία γλυκοπρωτεΐνη του πλάσματος, η οποία, πέρα από τον ρόλο της στην αιμόσταση, συμμετέχει επίσης στην αγγειογένεση και στις ανοσολογικές αποκρίσεις. Η συμβολή της στην αιμόσταση είναι πολυλειτουργική. Το σημαντικότερο είναι ότι λειτουργεί ως συγκολλητική μήτρα για τα αιμοπετάλια υπό υψηλές διατμητικές τάσεις, μέσω του συμπλέγματος του υποδοχέα GPIb/IX/V των αιμοπεταλίων (ή GPIbα), ως πρόσδεμα για την ιντεγκρίνη αIIbβ3 των αιμοπεταλίων, και ως μόριο-φορέας του παράγοντα πήξης VIII (FVIII), προστατεύοντάς τον από πρωτεολυτική αποδόμηση. Η παρούσα διατριβή διερευνά τον ρόλο της έκφρασης του VWF και των εξαρτώμενων από ιντεγκρίνες λειτουργιών των αιμοπεταλίων και χωρίζεται σε τρία μέρη.Πρώτον, χρησιμοποιώντας ένα πειραματικό μοντέλο ποντικιών για την αιμορροφιλία Α, εξετάσαμε την επίδραση της ανεπάρκειας FVIII στα επίπεδα VWF στο πλάσμα και τη σημασία της στην ανάπτυξη χαμηλού βαθμού ηπατικού φλεγμονώδους φαινοτύπου. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα ποντίκια με ανεπάρκεια F8 παρουσίασαν αυξημένα επίπεδα VWF στο πλάσμα, τα οποία δεν συσχετίστηκαν με αυξημένη σύνθεση ή μειωμένη εκκαθάριση του VWF, αλλά με αυξημένη έκφραση φλεγμονωδών γονιδίων στο ήπαρ. Η χορήγηση ανθρώπινου FVIII μείωσε τα επίπεδα VWF στο φυσιολογικό. Αξιοποιώντας την τεχνολογία δημιουργίας ποντικιών χωρίς μικροβίωμα (germ-free, GF), διερευνήσαμε την επίδραση του μικροβιώματος του εντέρου στην έκφραση του VWF σε ένα μοντέλο εναπόθεσης αιμοπεταλίων μετά από μηχανικό τραυματισμό της καρωτίδας. Τα GF ποντίκια εμφάνισαν μείωση στα επίπεδα VWF στο πλάσμα και στη σύνθεσή του στο ήπαρ, καθώς και μειωμένη εναπόθεση αιμοπεταλίων εξαρτώμενη από ιντεγκρίνες στην καρωτίδα μετά απο μηχανικό τραυματισμό ή σε καλυπτρίδες επικαλυμμένες με μήτρα για συγκόληση των αιμοπεταλίων, σε σύγκριση με τα συμβατικά (CONV-R) ποντίκια. Δείξαμε για πρώτη φορά ότι το μικροβίωμα του εντέρου απελευθερώνει μικροβιακά πρότυπα που επάγουν τη σύνθεση VWF μέσω σηματοδότησης του υποδοχέα Toll-like 2 (TLR2) στο ηπατικό ενδοθήλιο. Στο τρίτο μέρος, εξερευνήσαμε τη λειτουργία των ανθρώπινων αιμοπεταλίων που διαμεσολαβείται από την ιντεγκρίνη αIIbβ3 υπό συνθήκες υποξίας. Η επώαση απομονωμένων ανθρώπινων πλυμένων αιμοπεταλίων σε χαμηλά επίπεδα οξυγόνου οδήγησε σε μειωμένη ενεργοποίηση της ιντεγκρίνης αIIbβ3 μετά από διέγερση με αγωνιστές και σε μειωμένη συγκόλληση αιμοπεταλίων. Αυτό το αποτέλεσμα ήταν γρήγορο, αναστρέψιμο και δεν παρατηρήθηκε σε πλάσμα πλούσιο σε αιμοπετάλια. Μελέτες πρόσφυσης in vitro έδειξαν ότι η υποξία αναστέλλει ειδικά τη λειτουργία της υπομονάδας αIIb της ιντεγκρίνης αIIbβ3. Συλλογικά, η παρούσα διατριβή περιγράφει πώς παράγοντες όπως η κατάσταση μικροβιακής αποικιοποίησης του ξενιστή ή η έκθεση σε υποξία μπορούν να τροποποιήσουν την αλληλεπίδραση των ιντεγκρινών των αιμοπεταλίων με τις πρωτεΐνες της υποενδοθηλιακής μήτρας, επηρεάζοντας έτσι τη θρομβογόνο λειτουργία των αιμοπεταλίων και τη χαμηλού βαθμού ηπατική φλεγμονή.

Von Willebrand Factor (VWF) ist ein Plasma-Glykoprotein, welches eine Rolle in der Hämostase sowie in der Angiogenese und bei der Immunät spielt. Seine Rolle in der Hämostase ist multifunktional. Durch den Glykoprotein Ib (GPIb) Rezeptor und als Ligand für das Plättchenintegrin αIIbβ3 dient VWF als wichtiger Adhäsionskomplex für Plättchen unter Shear-Stress. Desweiteren ist VWF ein Carrier Molekül für den Gerinnungsfaktor VIII zum Schutz vor proteolytischem Abbau. Diese Arbeit erforscht die Rolle der VWF Expression und seiner Integrin-abhängigen Plättchenfunktion. Sie ist in drei Abschnitte unterteilt.

Im Hämophilie A Mausmodell wurde die die Wirkung von F8-Defizienz auf VWF Plasmaspiegel und die damit assoziierte phänotypischen Auswirkung auf die Ausbildung einer leicht ausgeprägten Leberentzündung untersucht. Interessanterweise zeigten F8-defiziente Mäuse erhöhte VWF Plasmaspiegel, welche unabhängig von einer erhöhten VWF-Synthese oder einem verminderten Abbau auftraten, aber scheinbar in Zusammenhang mit einer erhöhten inflammatorischen Genexpressionen standen. Supplementierung von humanen FVIII normalisierte die VWF Plasmaspiegel.

Mittels keimfreier Mausisolatortechnologie wurde die Rolle von Darmmikroben und deren Wirkung auf die VWF-Expression, die Plattchenaggregation und die Plättchendeposition in einem Ligation-induzierten Arteria carotis-Verletzungsmodell untersucht. Die keimfreien Mäuse zeigten im Vergleich zu konventionellaufgewachsenen Mäusen eine Reduktion der VWF-Plasmaspiegel, der hepatischen VWF-Synthese, sowie eine reduzierzte Integrin-abängige Plättchendeposition an die arterielle Verletzungsstelle. Hier wurde zum ersten Mal nachgewiesen, dass die Darmmikrobiota, über Toll-like Rezeptor-2 vermittelt, eine VWF-induzierende Funktion im Leberendothel ausüben.

Im dritten Teil der Arbeit wurde die αIIbβ3-abhängige Funktion menschlicher Plättchen unter Hypoxie untersucht. Die Isolation und Inkubation humaner Plättchen unter Hypoxie führte zu einer Beeinträchtigung der Agonisten-induzierten Aktivierung des αIIbβ3 Integrins und zu einer verminderten Thrombozytenaggregation. Dieser Effekt war schnell, reversibel und konnte nicht in Plättchen-reichem Plasma hervorgerufen werden. In vitro Adhesionsstudien zeigten, dass Hypoxie spezifisch die Funktion der αIIb Untereinheit inhibiert.

Zusammenfassend beschreibt die Arbeit, wie mikrobielle Besiedlung des Wirts und Hypoxie die Integrin-abhängige Thrombozytendeposition an subendotheliale Matrix beeinflusst. Erhöhte VWF-Plasmaspiegel unterstützen die arterielle Thrombozytendeposition und die Ausprägung eines Entzündungsphänotyps in der Leber.