Φαρμακομόρια πολλαπλής στόχευσης με πιθανή δράση σε νευροεκφυλιστικές και άλλες πολυπαραγοντικές νόσους: σχεδιασμός, σύνθεση και φαρμακολογική αξιολόγηση

Abstract

Neurodegeneration is a complex pathophysiological condition, that has been correlated to conditions, such as oxidative stress, inflammation and neuroinflammation, dysregulation of cholesterol homeostasis (inside and outside of the brain), accumulation of metal ions in neurons etc. Furthermore, there is an established relationship between metabolic syndrome and neurodegeneration, which renders metabolic syndrome a new, promising target against neurodegeneration. The aim of this dissertation is the design, synthesis and pharmacological evaluation of new multitarget compounds, as agents with potential antidegenerative properties, that will combine structural moieties with antioxidant, anti-inflammatory and antihyperlipidemic activity, as well as potential inhibitory activity against acetylcholinesterase. In this context, thiomorpholine and benzothiomorpholine core structures, based on previously developed inhibitors of squalene synthase, were combined with moieties that bear one or more other activities, such as antioxidant and/or anti-inflammatory. Such moieties are (poly)phenolic acids, chromane analogues and known NSAIDs. In total, 3 series of novel compounds were designed and synthesized via synthetic routes of 2-7 steps, in relatively good to excellent yields (50-99%). The final 39 compounds were characterized by 1H-NMR and 13C-NMR spectroscopy and were evaluated both in vitro and in vivo, for their antioxidant, anti-inflammatory and antihyperlipidemic properties, as well as their ability to chelate metal ions and inhibit acetylcholinesterase. Moreover, docking studies were performed, in an attempt to correlate the experimental and theoretical data, regarding the activity of the compounds on lipoxygenase and/or acetylcholinesterase. Further, cell cultures studies were conducted for selected derivatives of the first series, involving the evaluation of cytotoxicity/survival rates in their presence, as well as preliminary studies on the effect of two compounds on autophagy-related proteins. Finally, the probability for the crossing of the new compounds through the blood brain barrier was calculated. The first series of molecules (derivatives of chromane analogue Trolox, hydroxybenzoic acid derivative and its alcohol, esterified with known non-steroidal anti-inflammatory agents and nicotinic acid) had remarkable in vitro antioxidant properties, with the most active compounds bearing IC50 values of 0,8-7μΜ for lipid peroxidation and increasing the total antioxidant capacity of plasma by up to 761%. The best compounds inhibited the enzyme acetylcholinesterase by up to 90% at 150μM, while most of the compounds showed satisfactory anti-inflammatory properties, in vitro and in vivo. The second series of compounds (amides of thiomorpholine with phenolic acids and their analogues, BHT and derivative, Trolox, cinnamic or nicotinic acid and ibuprofen) showed significant results in vitro and in vivo, increasing plasma total antioxidant capacity by up to 800%. The anti-dyslipidemic properties were impressive, since all tested compounds contributed significantly to all lipid parameters, reducing total cholesterol, triglycerides and LDL by up to 70% and increasing HDL by up to 95%. Moreover, almost all compounds of this series increased the antiatheromatic index by 43-682%, which confirms the remarkable anti-dyslipidemic properties of all molecules. The anti-inflammatory activity of the new compounds was also significant, in vitro and in vivo. The third series of molecules (amides of benzothiomorpholine with phenolic acids and their derivatives, BHT and derivative, ibuprofen and hydroxy-benzothiomorpholine analogues with a naproxen-resembling moiety) had satisfactory in vitro antioxidant properties. The in vivo evaluation of the anti-dyslipidemic activity had impressive results, with all derivatives reducing lipid parameters of total cholesterol, triglycerides and LDL by almost 70% and increasing HDL levels by up to 130%. In total, the antiatheromatic index was elevated by 230-600%, underlining the remarkable anti-dyslipidemic activity of this series. The anti-inflammatory activity of the new derivatives was shown both in vitro and in vivo. In conclusion, the majority of the derivatives of the present dissertation confirmed both in vitro and in vivo at least two of three activities, for which they were initially designed (antioxidant, anti-inflammatory and antihyperlipidemic). Moreover, the interaction of the new compounds with the enzyme acetylcholinesterase showed promising results. At the same time, theoretical calculations of physicochemical properties of all new compounds, as well as their probability of crossing through blood brain barrier, show potential for CNS activity for 90% of the new compounds. This renders the best acting compounds of this dissertation as promising lead compounds for future research approaches towards the development of multitarget compounds against neurodegeneration and/or other multifactorial diseases.

Η νευροεκφύλιση αποτελεί μία πολυσύνθετη παθοφυσιολογική κατάσταση, η οποία συνδέεται αποδεδειγμένα με παράγοντες όπως το οξειδωτικό στρες, η φλεγμονή και η νευροφλεγμονή, η διαταραχή της ομοιόστασης της χοληστερόλης, η συσσώρευση ιόντων μετάλλων στους νευρώνες κ.α. Αποδεδειγμένη είναι, επίσης, η συσχέτισή της με το μεταβολικό σύνδρομο, το οποίο αποτελεί έναν νέο, υποσχόμενο στόχο για την αντιμετώπιση της νευροεκφύλισης. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν ο σχεδιασμός, η σύνθεση και η φαρμακολογική αξιολόγηση νέων πρωτότυπων πολυστοχεύοντων μορίων, που θα συνδυάζουν δομικά στοιχεία κατάλληλα, ώστε να τους προσδίδουν αντιοξειδωτική, αντιφλεγμονώδη και αντιυπερλιπιδαιμική δράση, αλλά και πιθανή ανασταλτική δράση επί της ακετυλοχολινεστεράσης. Στο πλαίσιο αυτό, συνδυάστηκαν θειομορφολινικοί και βενζοθειομορφολινικοί σκελετοί, με βάση προηγουμένως αναπτυγμένους αναστολείς της συνθετάσης του σκουαλενίου, αλλά και μόρια με μία ή περισσότερες νέες δράσεις, π.χ. αντιοξειδωτική ή/και αντιφλεγμονώδης δράσης, όπως πολυφαινολικά οξέα, χρωμανικά ανάλογα και ΜΣΑΦ. Συνολικά σχεδιάστηκαν 3 σειρές πρωτότυπων ενώσεων, οι οποίες συντέθηκαν με πορείες 2-7 σταδίων, σε καλές έως εξαιρετικές αποδόσεις (50-99%) για την πλειοψηφία των επιμέρους σταδίων. Τα 39 τελικά μόρια ταυτοποιήθηκαν μέσω φαρματοσκοπίας 1H-NMR και 13C-NMR και αξιολογήθηκαν φαρμακολογικά in vitro και in vivo, για την αντιοξειδωτική, αντιφλεγμονώδη και αντιυπερλιπιδαιμική δράση τους, καθώς και για την ικανότητα χηλικής δέσμευσης ιόντων σιδήρου και αναστολής της ακετυλοχολινεστεράσης. Πραγματοποιήθηκαν επίσης μελέτες μοριακών προσομοιώσεων για όλες τις ενώσεις, με στόχο την πιθανή συσχέτιση των πειραματικών δεδομένων με τα αντίστοιχα θεωρητικά για τα ένζυμα της λιποξυγονάσης ή/και της ακετυλοχολινεστεράσης ενώ πραγματοποιήθηκαν κυτταρικές δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας-επιβίωσης σε επιλεγμένα παράγωγα, καθώς και προκαταρκτικές μελέτες της επίδρασης δύο παραγώγων σε επίπεδα πρωτεϊνών σχετιζόμενων με την αυτοφαγία. Τέλος, υπολογίστηκε θεωρητικά η πιθανότητα διέλευσής τους μέσω του αιματεγκεφαλικού φραγμού, προϋπόθεση απαραίτητη, ώστε τα νέα μόρια να εκδηλώσουν τις δράσεις τους στο ΚΝΣ, εκτός από την περιφέρεια. Η πρώτη σειρά ενώσεων (παράγωγα του χρωμανικού αναλόγου Trolox και του υδροξυβενζοϊκού οξέος, εστεροποιημένα με γνωστά μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα και το νικοτινικό οξύ) είχε αξιοσημείωτη αντιοξειδωτική δράση in vitro, με τα δραστικότερα ανάλογα να έχουν τιμές IC50 0,8-7μΜ στην αναστολή της λιπιδικής υπεροξείδωσης και να αυξάνουν την ολική αντιοξειδωτική ικανότητα του πλάσματος των πειραματόζωων έως και 761%. Οι δραστικότερες ενώσεις ανέστειλαν την ακετυλοχολινεστεράση έως και 90% στη συγκέντρωση των 150μΜ, ενώ τα περισσότερα ανάλογα της σειράς έδειξαν ικανοποιητική αντιφλεγμονώδη δράση. Η δεύτερη σειρά ενώσεων (παράγωγα θειομορφολίνης αμιδοποιημένα με παράγωγα φαινολικών οξέων, ΒΗΤ και παράγωγό του, Trolox, κινναμωμικό ή νικοτινικό οξύ και ιβουπροφαίνη) παρουσίασε σημαντικά αποτελέσματα αντιοξειδωτικής δράσης in vitro και in vivo, αυξάνοντας την ολική αντιοξειδωτική ικανότητα του πλάσματος κατά έως 800%. Αξιοσημείωτη ήταν η αντι-δυσλιπιδαιμική δράση των ενώσεων, μειώνοντας σημαντικά την ολική χοληστερόλη, τα τριγλυκερίδια και την LDL έως και 70% και αυξάνοντας την HDL έως και 95%, ενώ ο αντιαθηρωματικός δείκτης αυξήθηκε σε ποσοστά 43-682% από όλα σχεδόν τα παράγωγα. Σημαντική ήταν και η αντιφλεγμονώδης δράση της σειράς, in vitro και in vivo. Η τρίτη σειρά μορίων (παράγωγα βενζοθειομορφολίνης αμιδοποιημένα με παράγωγα φαινολικών οξέων, ΒΗΤ και παράγωγό του και ιβουπροφαίνη, αλλά και υδροξυ-βενζοθειαζινικά ανάλογα με ενσωματωμένο δομικό τμήμα της ναπροξένης) είχε ικανοποιητική in vitro αντιοξειδωτική δράση. Επίσης, όλες οι ενώσεις μείωσαν σημαντικά τις λιπιδικές παραμέτρους της ολικής χοληστερόλης, των τριγλυκεριδίων και της LDL σε ποσοστά έως και 70%, ενώ αύξησαν τα επίπεδα της HDL έως και 130%. Συνολικά, ο αντιαθηρωματικός δείκτης αυξήθηκε εντυπωσιακά από το σύνολο των ενώσεων κατά 230-600%. Σημαντική ήταν και η αντιφλεγμονώδης δράση των παραγώγων in vitro και in vivo. Συμπερασματικά, η πλειοψηφία των ενώσεων της παρούσας διατριβής επιβεβαίωσαν in vitro και in vivo τουλάχιστον δύο από τις τρεις δράσεις, για τις οποίες σχεδιάστηκαν (αντιοξειδωτική, αντιφλεγμονώδης και αντιυπερλιπιδαιμική), ενώ ενθαρρυντικά ήταν τα αποτελέσματα της αναστολής του ενζύμου της ακετυλοχολινεστεράσης. Ταυτόχρονα, ο θεωρητικός υπολογισμός της πιθανότητας διέλευσης μέσω του αιματεγκεφαλικού φραγμού δείχνει θετικές προοπτικές για το 90% των ενώσεων, αναδεικνύοντας τα δραστικότερα ανάλογα ως ενώσεις-οδηγούς, για τις επόμενες ερευνητικές προσπάθειες ανάπτυξης πολυστοχεύοντων ενώσεων έναντι της νευροεκφύλισης και άλλων πολυπαραγοντικών νόσων.