Ο ρόλος των μικρών RNAs (miRNAs) στην αναπαραγωγική διαδικασία τριών ειδών τελεόστεων ιχθύων

Abstract

Reproduction plays a fundamental role on the successful development of Mediterranean aquaculture, yet dysfunctions in this process are still common and can negatively impact the domestication of new species. The aim of the present thesis was to investigate the role of microRNAs (miRNAs) in the reproductive physiology of three important Mediterranean marine fishes the gilthead seabream (Sparus aurata), the sharpsnout seabream (Diplodus puntazzo), and the greater amberjack (Seriola dumerili). Τhe gilthead seabream is fully adapted to captivity and expresses no reproductive dysfunction; however, it is a protandric hermaphrodite, functioning as male for the first two years of life and reversing sex to female at a percentage 15-80% at three years. The other two species are known to exhibit reproductive dysfunctions under captivity. A combination of gonad histological processing, small RNA sequencing, and bioinformatic analysis was employed, and comparative analyses were performed across gonadal stages. Histological observations reflected the reproductive status reported in previous studies: wild-caught sharpsnout seabream matured under captivity with farmed individuals remaining immature; greater amberjack were immature during their first reproductive season and exhibited ovarian atresia in the vitellogenic and the spent stages of a subsequent reproductive season; gilthead seabream exhibited a bisexual gonad consisting of an immature ovary and a mature testis in the male functional individuals and a mature ovary in the female functional individuals in the reproductive season, neither of them exhibiting any kind of reproductive dysfunctions. Histological profiles were in agreement with the total RNA profiles of the DNAnalyzer, where immature gonads exhibited more rRNA accumulation than mature gonads, with the exception of immature and vitellogenic greater amberjack ovaries and mature gilthead seabream testes. Small RNA libraries yielded read-length peaks at 19–24 nt, corresponding to miRNAs, and 25–30 nt, likely representing piRNAs. Differentially expressed (DE) miRNAs clustered by gonadal stage across species. In sharpsnout seabream, key DE miRNAs included ENSGACT0000029667.1, miR-451, miR-7a, ENSGACT00000029608.1 και ENSGACT00000029489.1; in greater amberjack, miR-100, miR-21, miR-202, miR-261, miR-99b and let-7g; and in gilthead seabream, let-7e/i/f, miR-21, miR-99b, miR-217 and miR-7. Moreover, miRNAs ENSGACT0000029667.1, miR-451, and ENSGACT00000029608.1 were found to be in higher abundance in the mature compared to the immature female gonads both of the sharpsnout and the gilthead seabream, from which miR-451 και ENSGACT00000029608.1 were also more expressed in the mature testes of the gilthead seabream, a fact which suggests that the specific miRNAs are probably involved in fish gonad maturation. Notably, DE miRNAs in the sharpsnout seabream form probable hybridizations with opposite expressed long non-coding RNAs (lncRNAs), unraveling a possible role of lncRNAs in sharpsnout seabream reproductive biology. Moreover, miR-125c, upregulated in immature sharpsnout seabream, was predicted to target the receptor of the follicle stimulating hormone, fshr, with its seed region binding to the 3’UTR of the sharpsnout and the gilthead seabream gene, the first one being a rudimentary and the second one a protandric hermaphroditic species, both belonging to the family Sparidae. In the greater amberjack, immature gonads exhibited more upregulated miRNAs compared to the vitellogenic and the spent stage, while miRNAs targeting genes responsible for oocyte apoptosis were identified, such as let-7g, miR-21 and miR-100a-1, which were less expressed in the spent gonadal stage. In the gilthead seabream, the fancl and fancd2 genes showed a strong male-specific expression, while the fancl and fancc genes had higher expression in the mature females compared to the ovarian part of the male gonads. These genes form members of the fanc (Fanconi anemia genes) gene family, which was until recently related to DNA repair, but recently has been correlated to gonad maturation and sex reversal in teleost fishes. At the same time, the miRNAs miR-210, miR-10926 and miR-217, other than opposite expression patterns, showed complete seed region complementarity to the 3′UTRs of fancd2, fancl and fancc, respectively. In the sharpsnout seabream, miR-210 and miR-217 showed similar expression patterns to the corresponding miRNAs in the gilthead seabream, as they did not show differential expression between the two ovarian stages, while in the greater amberjack, both miR-210 and miR-217 were more expressed in immature individuals. MiR-10926 was not detected in the gonadal samples of neither the sharpsnout seabream nor the greater amberjack. As regards common differentially expressed miRNAs in the three different comparisons between immature and mature gonads of the three different species of the present study, miR- -451 was found to be differentially expressed in all three comparisons, more expressed in mature ovaries of sharpsnout and gilthead seabream and in immature ovaries of greater amberjack, possibly reflecting the phylogenetic relationships between the species. A phylogenetic analysis of the fanc genes was conducted and the possible conservation of the binding site of the miRNAs with the fanc genes’ 3’UTRs was examined in the three different species of the present study. A close evolutionary relationship was found between fancc, fαncl and fancd2 genes and a great similarity in the miR-217, miR-10296 and miR-210 binding sites’sequences among the Sparidae gilthead and sharpsnout seabream, but not for the greater amberjack, indicating that the regulatory functions of miRNAs follow the evolutionary relationships between different fish species. The findings of the present thesis highlight a central role of miRNAs in regulating gonadal development, apoptosis and sex reversal, and suggest potential applications of miRNAs as biomarkers of reproductive capacity or as targets for future gene-editing strategies to improve reproductive performance in cultured fish species.

H επιτυχής αναπαραγωγή αποτελεί θεμελιώδη παράμετρο για την ανάπτυξη της μεσογειακής ιχθυοκαλλιέργειας, καθώς σε συνθήκες εκτροφής παρατηρούνται συχνά δυσλειτουργίες στη διαδικασία αυτή. Η παρούσα διατριβή έχει εστιάσει στον ρόλο των μικρών μη κωδικοποιητικών RNAs (miRNAs) στην αναπαραγωγική φυσιολογία τριών ειδών εκτρεφόμενων ιχθύων στη μεσογειακή ιχθυοκαλλιέργεια: της τσιπούρας (Sparus aurata), του μυτακιού (Diplodus puntazzo) και του μαγιάτικου (Seriola dumerili). Η τσιπούρα είναι το κυριότερο θαλάσσιο είδος εκτροφής στην Μεσόγειο και αποτελεί ένα κατεξοχήν μελετημένο πρότυπο λόγω του πρωτανδρικού ερμαφροδιτισμού της. Τα άλλα δύο είδη παρουσιάζουν δυσκολίες στην ωρίμανση και την ωοτοκία υπό συνθήκες εκτροφής. Η μελέτη βασίστηκε σε συνδυασμό ιστολογικών αναλύσεων, προφίλ sncRNA μέσω RNA-seq, και βιοπληροφορικής διερεύνησης στόχων miRNAs. Πραγματοποιήθηκε σύγκριση μεταξύ διαφορετικών σταδίων γοναδικής ανάπτυξης, με στόχο τον εντοπισμό διαφοροποιημένων προτύπων έκφρασης miRNAs και την πιθανή εμπλοκή τους σε σημαντικές αναπαραγωγικές διεργασίες. Παράλληλα, και λόγω του πιθανού ρόλου των γονιδίων της οικογένειας fanc (Fanconi anemia genes) στην ωρίμανση και στην αναστροφή φύλου στους ιχθύες, χρησιμοποιήθηκαν qPCR αναλύσεις για τη διερεύνηση της έκφρασης των γονιδίων αυτών στην τσιπούρα. Η ιστολογική μελέτη έδειξε ότι τα αλιευμένα μυτάκια ωρίμασαν, ενώ τα εκτρεφόμενα έμειναν σε ανώριμο στάδιο κατά την αναπαραγωγική περίοδο. Τα εκτρεφόμενα μαγιάτικα ήταν ανώριμα την πρώτη τους αναπαραγωγική περίοδο και εμφάνισαν σημάδια ατρησίας στις ωοθήκες τους κατά τη διάρκεια και προς το τέλος επόμενης αναπαραγωγικής τους περιόδου, ενώ οι τσιπούρες είχαν διαφυλετικές γονάδες με ώριμο ορχικό και ανώριμο ωοθηκικό ιστό στα ενεργά αρσενικά τους άτομα και ώριμες θηλυκές γονάδες στα ενεργά θηλυκά άτομα κατά την αναπαραγωγική τους περίοδο, μην εμφανίζοντας καμία δυσλειτουργία, καθώς είναι ένα είδος πλήρως προσαρμοσμένο σε συνθήκες εκτροφής. Τα ανώριμα δείγματα γονάδων έδειξαν μεγαλύτερη συσσώρευση 5S rRNA από τα ώριμα δείγματα, με εξαίρεση τα δείγματα των ανώριμων και λεκιθογενών μαγιάτικων και των ώριμων αρσενικών γονάδων της τσιπούρας. Όσον αφορά στον αριθμό των αναγνώσεων, ο μέσος όρος για όλα τα δείγματα ήταν πάνω από 10 εκατομμύρια, ο οποίος θεωρείται ικανοποιητικός για τη βιοπληροφορική ανάλυση που ακολούθησε. Επιπλέον, παρουσιάστηκαν δύο κορυφές στα μήκη των αναγνώσεων, μια στα 19-24 νουκλεοτίδια, που αντιστοιχεί στα miRNAs και μία στα 25-30 νουκλεοτίδια, που αντιστοιχεί σε πιθανά piRNAs. Οι κυριότεροι τύποι RNA που βρέθηκαν ήταν τα γονίδια ριβοσωμικού RNA (rRNA) και τα miRNAs και στα τρία είδη ιχθύων, ενώ τα προφίλ των μη κωδικοποιητικών RNAs και των διαφορικά εκφρασμένων miRNAs ομαδοποιήθηκαν με βάση το στάδιο ανάπτυξης της γονάδας και στα τρία υπό μελέτη είδη. Στο μυτάκι, τα πιο σημαντικά διαφορικά εκφραζόμενα miRNAs ήταν τα ENSGACT0000029667.1, miR-451, miR-7a, ENSGACT00000029608.1 και ENSGACT00000029489.1, στο μαγιάτικο τα miR-100, miR-21, miR-202, miR-261, miR-99b, let-7g, miR-7550 και στην τσιπούρα τα let-7e, let-7i, let-7f, miR-21, miR-99b, miR-217 και miR-7. Μάλιστα, τα miRNAs ENSGACT0000029667.1, miR-451 και ENSGACT00000029608.1 είχαν μεγαλύτερη αφθονία στις ώριμες σε σχέση με τις ανώριμες θηλυκές γονάδες τόσο του μυτακιού όσο και της τσιπούρας, και από αυτά τα miR-451 και ENSGACT00000029608.1 ήταν επίσης περισσότερο εκφρασμένα και στους ώριμους όρχεις της τσιπούρας, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα συγκεκριμένα miRNAs πιθανώς εμπλέκονται στην ωρίμανση των γονάδων των ιχθύων. Τα διαφορικά εκφρασμένα miRNAs στο μυτάκι φαίνεται να σχηματίζουν πιθανούς υβριδισμούς με αντίθετα εκφρασμένα lncRNAs, επισημαίνοντας πιθανό δικό τους ρόλο στην αναπαραγωγική βιολογία του μυτακιού, ενώ το miR-125c, που εντοπίστηκε περισσότερο εκφρασμένο στα ανώριμα μυτάκια, βρέθηκε να έχει ως στόχο το γονίδιο του υποδοχέα της ωοθηλακιοτρόπου ορμόνης (Follicle stimulating hormone receprotor, fshr), με τον καλύτερο υβριδισμό της seed region και του 3’UTR του γονιδίου να εντοπίζεται στο μυτάκι και στην τσιπούρα, δύο στενά συγγενικά είδη (οικογένεια Sparidae) που εμφανίζουν στοιχειώδη ερμαφροδιτισμό και πρωτανδρισμό, αντίστοιχα. Στο μαγιάτικο, η ανώριμη γονάδα εμφάνισε περισσότερα miRNAs που υπερεκφράζονται σε σχέση με τα άλλα δύο στάδια, ενώ εντοπίστηκαν miRNAs που στοχεύουν γονίδια υπεύθυνα για την απόπτωση των ωοκυττάρων, όπως τα τα let-7g, miR-21 και miR-100a-1, τα οποία ήταν λιγότερο εκφρασμένα στο τέλος της αναπαραγωγικής περιόδου. Στην τσιπούρα τα miR-210, miR-217 και miR-10926 εμφάνισαν έντονη διαφοροποιημένη έκφραση και φαίνεται να ρυθμίζουν δυνητικά την έκφραση των γονιδίων-μελών της οικογένειας fanc, η οποία μέχρι πρόσφατα συνδεόταν κυρίως με επιδιόρθωση DNA, αλλά πρόσφατα έχει αναφερθεί πιθανός ρόλος της στην ωρίμανση των γονάδων και στην αναστροφή φύλου. Τα γονίδια fancl και fancd2 έδειξαν μια έντονη ειδική για τα αρσενικά έκφραση, ενώ τα γονίδια fancl και fancc, είχαν υψηλότερη έκφραση στις ενεργές θηλυκές γονάδες σε σχέση με τα ωοθηκικά τμήματα των αρσενικών γονάδων. Ταυτόχρονα, τα miRNAs miR-210, miR-10926 και miR-217 εντοπίστηκαν να έχουν, εκτός από αντίθετη έκφραση, και πλήρη συμπληρωματικότητα της seed region τους με τα 3’UTR των fancd2, fancl και fancc, αντίστοιχα. Στο μυτάκι, τα miR-210 και miR-217 παρουσίασαν παρόμοια πρότυπα έκφρασης με τα αντίστοιχα miRNAs της τσιπούρας, καθώς δεν εμφάνισαν διαφοροποιημένη έκφραση μεταξύ των δύο σταδίων των ωοθηκών, ενώ στο μαγιάτικο, τόσο το miR -210 όσο και το miR-217 ήταν περισσότερο εκφρασμένα στα ανώριμα άτομα. Το miR-10926 δεν εντοπίστηκε στα δείγματα γονάδων του μυτακιού και του μαγιάτικου. Όσον αφορά στα κοινά διαφορικά εκφρασμένα miRNAs μεταξύ των συγκρίσεων ανώριμων και ώριμων ωοθηκών στην παρούσα μελέτη, το miR-451 βρέθηκε να είναι διαφορετικά εκφρασμένο και στις τρεις συγκρίσεις μεταξύ ανώριμων και ώριμων ωοθηκών, περισσότερο εκφρασμένο στις ώριμες γονάδες του μυτακιού και της τσιπούρας και στις ανώριμες στο μαγιάτικο. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε φυλογενετική ανάλυση των τριών γονιδίων fanc και ελέγχθηκε η πιθανή συντήρηση της θέσης δέσμευσης των 3’UTRs τους με τα αντίστοιχα miRNAs των τριών ειδών της παρούσας μελέτης. Βρέθηκε στενή εξελικτική σχέση μεταξύ των γονιδίων fancc, fαncl και fancd2 και μεγάλη ομοιότητα στις αλληλουχίες των θέσεων δέσμευσης των miRNAs miR-217, miR-10926 και miR-210 μεταξύ των σπαροειδών τσιπούρα και μυτάκι, αλλά όχι για το μαγιάτικο, πράγμα που υποδεικνύει ότι οι ρυθμιστικές λειτουργίες των miRNAs ακολουθούν τις εξελικτικές σχέσεις μεταξύ των διαφορετικών ειδών ιχθύων. Συμπερασματικά, στην παρούσα διατριβή, μελετήθηκε η διαφορική έκφραση των miRNAs στις γονάδες τριών διαφορετικών ειδών εκτρεφόμενων ειδών ιχθύων, και αναδείχθηκε ο κεντρικός ρόλος τους στη γονιδιακή ρύθμιση της αναπαραγωγής των ιχθύων σε όλα τα επίπεδά της, όπως η στεροειδογένεση, η απόπτωση και η αναστροφή φύλου, εμπλουτίζοντας τις γνώσεις μας για τους επιγενετικούς μηχανισμούς που την διέπουν. Τα αποτελέσματα της διατριβής παρέχουν δυνητικά νέα εργαλεία για την αντιμετώπιση των αναπαραγωγικών δυσλειτουργιών των εκτρεφόμενων ειδών, κυρίως υπό τη μορφή ανεύρεσης πιθανών βιοδεικτών αναπαραγωγικής ικανότητας που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την καλύτερη επιλογή αλλά και διαχείριση γεννητόρων, καθώς και για την πιθανή αξιοποίησή τους σε τεχνολογίες γονιδιακής επεξεργασίας (π.χ. CRISPR/Cas) για τη βελτίωση της αναπαραγωγής σε εκτρεφόμενα είδη.