Study of the interactions between glucocorticoids and neurotrophins in physiological and neuropathological conditions

Abstract

Glucocorticoids (GCs), the end product of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis and the primary effector hormones of stress, exhibit complex temporal dynamics characterized by both circadian and ultradian rhythmicity that are crucial for maintaining physiological homeostasis and adaptive stress responses. Acting through two types of receptors, the high affinity Mineralocorticoid Receptor (MR) and the Glucocorticoid Receptor (GR), these hormones are considered crucial as mediators of anti-inflammatory effects, which have been extensively studied in immune contexts. However, their role in regulating neuroinflammation, particularly in brain glia cells like astrocytes, remains poorly understood. Astrocytes, the most abundant glial cells in the central nervous system, serve as critical mediators of neuroinflammatory responses and express high levels of glucocorticoid receptors, making them prime targets for GC signaling. However, current research has predominantly focused on static hormone administration paradigms that fail to recapitulate the dynamic nature of physiological GC secretion patterns. This limitation represents a significant gap in understanding how temporal aspects of GC signaling influence astrocytic function and neuroinflammatory responses. Furthermore, the interaction between GC and neurotrophic factors, specifically the main CNS neurotrophin, brain-derived neurotrophic factor (BDNF), two major brain molecules that functionally converge in stress-related brain disorders, has not been systematically investigated in astrocytes. The primary aim of this dissertation was to investigate how different patterns of GC rhythmicity, with particular emphasis on ultradian pulsatility, influence astrocytic biology and neuroinflammatory responses. To address this, four complementary objectives were undertaken. The first objective characterized GC-BDNF interactions in primary mouse astrocytes to understand the mechanistic foundations of stress hormone-neurotrophin crosstalk. The second objective involved the development and validation of a novel microfluidic platform capable of delivering physiologically relevant GC secretion patterns with high temporal and concentration precision. The third objective established a reliable protocol for translating the aforementioned knowledge establishing differentiation protocols of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) towards functional astrocytes and successfully integrating them with the microfluidic system. The fourth objective systematically assessed the impact of distinct GC administration patterns on human astrocytic function, with emphasis on transcriptional regulation, inflammatory responses, and potential implications for protein clearance mechanisms. Our investigation on the GC-BDNF interactions revealed a novel biphasic response pattern in astrocytes that fundamentally differs from neuronal responses. Corticosterone exposure induced rapid BDNF mRNA upregulation within the first hour, mediated by TrkB receptor phosphorylation through non-genomic mechanisms independent of classical GR signaling. The mechanistic analysis demonstrated that corticosterone rapidly phosphorylates TrkB receptors within 20 minutes, reaching peak activation comparable to exogenous BDNF stimulation. Importantly, TrkB inhibition completely abolished the early BDNF upregulation, establishing a causal relationship between rapid receptor phosphorylation and transcriptional activation. This early response was followed by sustained BDNF suppression over 6-24 hours, which proved to be GR-dependent and could be reversed by GR antagonism. This biphasic pattern was normalized by a second corticosterone pulse, highlighting the importance of ultradian rhythmicity in maintaining neurotrophin homeostasis.In order to properly study physiological and pathological human ultradian pulsatility while at the same time increasing the translatability of my results, new innovative methodological approaches had to be employed: a) a microfluidic platform was custom-designed using pressure-controlled pumps, high-accuracy flow sensors, and microfluidic mixing interfaces to generate three distinct GC delivery profiles: physiological pulsatile (Profile 1), steady-state (Profile 2), and aberrant rhythmic patterns (Profile 3) mimicking stress-related disorders and b) human iPSC-derived astrocytes were generated after adaptations on an established differentiation protocol and characterization for astrocytic maturation, morphology, and functional responses. The microfluidic platform successfully reproduced physiologically relevant ultradian GC patterns with unprecedented precision and stability. The system demonstrated the ability to generate consistent 3-hour pulsatile profiles over extended periods (24-48 hours) while maintaining cell viability under carefully controlled shear stress conditions (0.01-0.1 dyne/cm²). Integration with human iPSC-derived astrocytes revealed that these cells express appropriate astrocytic markers, maintain characteristic morphology, and respond appropriately to inflammatory stimuli. Importantly, the hiPSC-astrocytes demonstrated GC responsiveness with GR expression levels significantly higher than MR levels, closely mirroring human brain tissue patterns. The central finding of this research demonstrated that the temporal pattern of GC exposure—specifically ultradian pulsatility versus steady-state delivery—dramatically modulates astrocytic neuroinflammatory responses despite identical cumulative hormone exposure. Physiological pulsatile GC delivery (Profile 1) maintained anti-inflammatory astrocytic phenotypes with minimal cytokine expression, while steady-state administration (Profile 2) triggered robust pro-inflammatory activation characterized by upregulation in IL-6, IL-8, CCL5, IFN-γ and CXCL10 cytokine expression. Aberrant ultradian pulsatile patterns (Profile 3), designed to mimic stress-related disorders, induced similar inflammatory responses. Pharmacological analysis using mifepristone revealed that these differential effects were primarily GR-mediated, with steady exposure promoting sustained GR activation and inflammatory gene transcription.Remarkably, extended exposure experiments (48 hours) revealed evidence for self-resolving inflammatory mechanisms in astrocytes under steady GC conditions. This resolution was associated with compensatory upregulation of GRα at 24 hours and upregulation of IL-1 receptor antagonist (IL1Ra) at 48 hours in the steady administration profile, suggesting intrinsic adaptive mechanisms that attempt to restore homeostatic balance. Furthermore, preliminary analysis of protein clearance markers (AQP4 and LRP1) indicated potential downward trends under non-physiological GC patterns, suggesting implications for astrocytic clearance capacity relevant to neurodegenerative processes. The clinical implications of these findings are substantial, providing mechanistic insights into how disrupted cortisol rhythms contribute to neuroinflammation in stress-related and neurodegenerative disorders. This research validates the therapeutic potential of chronotherapeutic approaches that restore physiological pulsatility rather than simply modulating hormone levels. The methodological innovations, particularly the microfluidic platform, address critical gaps in chronopharmacological research and provide a technological framework for studying temporal aspects of hormone action, while the successful integration of human iPSC-derived astrocytes enhances translational relevance by eliminating species-specific confounding factors. This work advances understanding of astrocyte biology by demonstrating that temporal dynamics of GC signaling represent primary determinants of astrocytic inflammatory responses and adaptive mechanisms. The findings challenge traditional dose-response paradigms of GC action and establish that physiological pulsatility preserves anti-inflammatory phenotypes while aberrant delivery patterns trigger pathological activation. The identification of self-resolving inflammatory mechanisms and their temporal coordination provides new insights into astrocytic homeostatic plasticity. These discoveries contribute to the emerging paradigm of precision medicine and personalized chronotherapy, offering mechanistic evidence that individual differences in cortisol rhythmicity may require personalized therapeutic approaches. The research establishes a methodological framework for investigating temporal drug delivery effects and provides a pathway toward developing chronobiologically informed treatment protocols that optimize therapeutic efficacy while minimizing adverse effects.Importantly, these results could be pharmacologically exploited in the context of neurological disorders characterized by chronic neuroinflammation, such as Alzheimer’s disease and major depressive disorder, by guiding the development of GC-based interventions that restore physiological oscillatory profiles rather than relying on continuous or daily single-dosing. Such chronotherapeutic strategies may improve therapeutic responsiveness, limit detrimental inflammatory signaling, and preserve physiological astrocytic function which is compromised in these conditions. Ultimately, the temporal precision of GC modulation presents a promising avenue for enhancing drug efficacy while minimizing long-term adverse outcomes in vulnerable patient populations.

Οι γλυκοκορτικοειδείς ορμόνες (GCs), το τελικό προϊόν του άξονα υποθαλάμου-υπόφυσης-επινεφριδίων και οι κύριες ορμόνες-εκτελεστές της αντίδρασης στο στρες, παρουσιάζουν σύνθετη χρονική δυναμική που χαρακτηρίζεται τόσο από κιρκάδιους όσο και υπερκιρκάδιους ρυθμούς, οι οποίοι είναι κρίσιμοι για τη διατήρηση της φυσιολογικής ομοιόστασης και των προσαρμοστικών αποκρίσεων στο στρες. Δρώντας μέσω δύο τύπων υποδοχέων, του υψηλής συγγένειας υποδοχέα μεταλλοκορτικοειδών (MR) και του υποδοχέα γλυκοκορτικοειδών (GR), οι ορμόνες αυτές θεωρούνται καθοριστικής σημασίας ως μεσολαβητές αντιφλεγμονωδών επιδράσεων, οι οποίες έχουν μελετηθεί εκτενώς σε ανοσολογικά πλαίσια. Ωστόσο, ο ρόλος τους στη ρύθμιση της νευροφλεγμονής, ιδίως σε γλοιακά κύτταρα του εγκεφάλου όπως τα αστροκύτταρα, παραμένει ελλιπώς κατανοητός. Τα αστροκύτταρα, τα πιο άφθονα γλοιακά κύτταρα του κεντρικού νευρικού συστήματος, αποτελούν βασικούς ρυθμιστές των νευροφλεγμονωδών αποκρίσεων και εκφράζουν υψηλά επίπεδα υποδοχέων γλυκοκορτικοειδών, καθιστώντας τα κύριους στόχους της σηματοδότησης των GCs. Ωστόσο, η πρόσφατη μελέτη τους έχει επικεντρωθεί κυρίως σε στατικά πρότυπα χορήγησης ορμονών που δεν αντικατοπτρίζουν τη δυναμική φύση των φυσιολογικών προτύπων έκκρισης των GCs. Αυτό το περιορισμένο πειραματικό πλαίσιο συνιστά σημαντικό κενό στην κατανόηση του τρόπου με τον οποίο οι χρονικές πτυχές της σηματοδότησης των GCs επηρεάζουν τη λειτουργία των αστροκυττάρων και τις νευροφλεγμονώδεις αντιδράσεις τους. Επιπλέον, η αλληλεπίδραση μεταξύ των GCs και των νευροτροφικών παραγόντων, και συγκεκριμένα της κύριας νευροτροφίνης του κεντρικού νευρικού συστήματος, του νευροτροφικού παράγοντα που προέρχεται από τον εγκέφαλο (BDNF), δύο βασικών μοριακών συστημάτων του εγκεφάλου που συγκλίνουν λειτουργικά σε διαταραχές σχετιζόμενες με το στρες, δεν έχει διερευνηθεί συστηματικά στα αστροκύτταρα. Ο κύριος στόχος της παρούσας διατριβής ήταν να διερευνήσει πώς διαφορετικά πρότυπα ρυθμικότητας των GCs, με ιδιαίτερη έμφαση στην υπερκιρκαδική παλμικότητα, επηρεάζουν τη βιολογία των αστροκυττάρων και τις νευροφλεγμονώδεις αποκρίσεις τους. Για την επίτευξη αυτού, σχεδιάστηκαν τέσσερεις συμπληρωματικοί ερευνητικοί στόχοι. Ο πρώτος στόχος περιελάμβανε τον χαρακτηρισμό των αλληλεπιδράσεων μεταξύ GCs και BDNF σε πρωτογενή αστροκύτταρα ποντικού, προκειμένου να κατανοηθεί ο μηχανιστικός πυρήνας της διασταύρωσης μεταξύ των οδών του στρες και των νευροτροφινών. Ο δεύτερος στόχος περιελάμβανε την ανάπτυξη και επικύρωση μιας καινοτόμου μικροφλουιδικής πλατφόρμας ικανής να παρέχει φυσιολογικά και παθολογικά πρότυπα έκκρισης GCs με υψηλή ακρίβεια ελέγχου χρόνου και συγκέντρωσης. Στον τρίτο στόχο καθιερώθηκε ένα αξιόπιστο πρωτόκολλο με στόχο την αξιοποίηση της προαναφερθείσας γνώσης, μέσω της διαφοροποίησης ανθρώπινων επαγώγιμων πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων (hiPSCs) προς λειτουργικά αστροκύτταρα τα οποία ενσωματώθηκαν επιτυχώς στο μικροφλουιδικό σύστημα. Στον τέταρτο στόχο αξιολογήθηκε συστηματικά η επίδραση διακριτών προτύπων χορήγησης GCs στη λειτουργία των ανθρώπινων αστροκυττάρων, με έμφαση στη μεταγραφική ρύθμιση, στις φλεγμονώδεις αποκρίσεις και στις πιθανές επιπτώσεις σε μηχανισμούς απομάκρυνσης πρωτεϊνών. Η διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων GC–BDNF αποκάλυψε ένα νέο διφασικό πρότυπο απόκρισης στα αστροκύτταρα, το οποίο διαφέρει θεμελιωδώς από αυτό των νευρώνων. Η έκθεση σε κορτικοστερόνη προκάλεσε ταχεία αύξηση των επιπέδων mRNA του BDNF εντός της πρώτης ώρας, μέσω φωσφορυλίωσης των υποδοχέων TrkB, με μηχανισμό μη-γονιδιακής φύσης και ανεξάρτητο της κλασικής GR σηματοδότησης. Η μηχανιστική ανάλυση έδειξε ότι η κορτικοστερόνη φωσφορυλιώνει γρήγορα τους υποδοχείς TrkB μέσα σε 20 λεπτά, φτάνοντας σε επίπεδα ενεργοποίησης συγκρίσιμα με την εξωγενή διέγερση από BDNF. Η αναστολή του TrkB κατήργησε πλήρως την αρχική αύξηση του BDNF, αποδεικνύοντας αιτιώδη σχέση μεταξύ της ταχείας φωσφορυλίωσης του υποδοχέα και της μεταγραφικής ενεργοποίησης. Αυτή η πρώιμη απόκριση ακολουθήθηκε από παρατεταμένη καταστολή του BDNF (6–24 ώρες), η οποία εξαρτάται από τον GR και αναστρέφεται με GR ανταγωνισμό. Το διφασικό αυτό μοτίβο ομαλοποιήθηκε με έναν δεύτερο παλμό κορτικοστερόνης, αναδεικνύοντας τη σημασία της υπερκιρκαδικής ρυθμικότητας για τη διατήρηση της νευροτροφινικής ομοιόστασης. Προκειμένου να μελετηθεί κατάλληλα η φυσιολογική και παθολογική ανθρώπινη υπερκιρκαδική παλμικότητα, ενώ παράλληλα να ενισχυθεί η μεταφραστική αξία των αποτελεσμάτων, εφαρμόστηκαν νέες, καινοτόμες μεθοδολογικές προσεγγίσεις: α) σχεδιάστηκε μια μικροφλουιδική πλατφόρμα με αντλίες ελεγχόμενης πίεσης, αισθητήρες υψηλής ακρίβειας και διεπαφές ανάμειξης μικρορροής, ικανή να δημιουργεί τρία διακριτά προφίλ χορήγησης GCs — φυσιολογικά παλμικό (Προφίλ 1), σταθερό (Προφίλ 2) και παθολογικά παλμικό (Προφίλ 3) που μιμείται διαταραχές σχετιζόμενες με το στρες· β) παράχθηκαν ανθρώπινα αστροκύτταρα από hiPSCs έπειτα από προσαρμογές σε καθιερωμένο πρωτόκολλο διαφοροποίησης και χαρακτηρίστηκαν ως προς την ωρίμανση, τη μορφολογία και τις λειτουργικές αποκρίσεις τους. Η μικροφλουιδική πλατφόρμα αναπαρήγαγε με ακρίβεια και σταθερότητα φυσιολογικά υπερκιρκαδικά πρότυπα GCs. Το σύστημα απέδειξε την ικανότητα παραγωγής σταθερών παλμών διάρκειας 3 ωρών για εκτεταμένες περιόδους (24–48 ώρες), διατηρώντας ταυτόχρονα τη βιωσιμότητα των κυττάρων υπό αυστηρά ελεγχόμενες συνθήκες διατμητικής πίεσης (0.01–0.1 dyne/cm²). Η ενσωμάτωση των ανθρώπινων hiPSC-αστροκυττάρων στο σύστημα αποκάλυψε ότι αυτά τα κύτταρα εκφράζουν τους κατάλληλους αστροκυτταρικούς δείκτες, διατηρούν τη χαρακτηριστική μορφολογία τους και ανταποκρίνονται σωστά σε φλεγμονώδη ερεθίσματα. Επιπλέον, τα hiPSC-αστροκύτταρα έδειξαν λειτουργική ανταπόκριση στα GCs, με τα επίπεδα έκφρασης GR να είναι σημαντικά υψηλότερα από εκείνα του MR, αντικατοπτρίζοντας τα πρότυπα που παρατηρούνται στον ανθρώπινο εγκέφαλο. Το κεντρικό εύρημα της έρευνας μας απέδειξε ότι το χρονικό μοτίβο έκθεσης στα GCs — και συγκεκριμένα η υπερκιρκαδική παλμικότητα έναντι της σταθερής χορήγησης — τροποποιεί δραματικά τις νευροφλεγμονώδεις αποκρίσεις των αστροκυττάρων, παρά την ίδια συνολική ποσότητα ορμόνης. Η φυσιολογική παλμική χορήγηση GCs (Προφίλ 1) διατήρησε αντιφλεγμονώδη φαινότυπο με ελάχιστη έκφραση κυτοκινών, ενώ η σταθερή χορήγηση (Προφίλ 2) προκάλεσε έντονη προφλεγμονώδη ενεργοποίηση, χαρακτηριζόμενη από υπερέκφραση των IL-6, IL-8, CCL5, IFN-γ και CXCL10 κυτοκινών. Το παθολογικό παλμικό πρότυπο (Προφίλ 3), που σχεδιάστηκε ώστε να μιμείται διαταραχές σχετιζόμενες με το στρες, προκάλεσε παρόμοιες φλεγμονώδεις αποκρίσεις. Η φαρμακολογική ανάλυση με χρήση της μιφεπριστόνης έδειξε ότι οι διαφοροποιημένες αυτές δράσεις ήταν κυρίως GR-εξαρτώμενες, με τη σταθερή έκθεση να οδηγεί σε παρατεταμένη ενεργοποίηση του GR και μεταγραφική επαγωγή φλεγμονωδών γονιδίων. Tα πειράματα παρατεταμένης έκθεσης (48 ώρες) αποκάλυψαν ενδείξεις αυτο-ρυθμιζόμενων, αυτο-ανασταλτικών μηχανισμών φλεγμονής στα αστροκύτταρα υπό σταθερή χορήγηση GCs. Αυτή η αποκατάσταση συνδέθηκε με αντισταθμιστική αύξηση του GRα στις 24 ώρες και αύξηση του ανταγωνιστή του υποδοχέα IL-1 (IL1Ra) στις 48 ώρες, υποδεικνύοντας την ύπαρξη εσωτερικών προσαρμοστικών μηχανισμών που επιδιώκουν την αποκατάσταση της ομοιόστασης. Επιπλέον, η προκαταρκτική ανάλυση δεικτών απομάκρυνσης πρωτεϊνών (AQP4 και LRP1) έδειξε πτωτικές τάσεις υπό μη φυσιολογικά πρότυπα GCs, υποδεικνύοντας πιθανή μείωση της ικανότητας καθαρισμού των αστροκυττάρων, σχετική με νευροεκφυλιστικές διεργασίες. Οι κλινικές συνέπειες αυτών των ευρημάτων είναι σημαντικές, προσφέροντας μηχανιστικές εξηγήσεις για το πώς οι διαταραγμένοι ρυθμοί κορτιζόλης συμβάλλουν στη νευροφλεγμονή σε διαταραχές που σχετίζονται με το στρες και τη νευροεκφύλιση. Η έρευνα αυτή υποστηρίζει τη θεραπευτική αξία χρονοθεραπευτικών προσεγγίσεων που στοχεύουν στην αποκατάσταση της φυσιολογικής παλμικότητας αντί της απλής ρύθμισης των επιπέδων των ορμονών. Οι μεθοδολογικές καινοτομίες — ιδίως η μικροφλουιδική πλατφόρμα — καλύπτουν κρίσιμα κενά στη χρονοφαρμακολογία και προσφέρουν ένα τεχνολογικό πλαίσιο για τη μελέτη των χρονικών πτυχών της δράσης των ορμονών, ενώ η επιτυχής ενσωμάτωση των ανθρώπινων hiPSC-αστροκυττάρων ενισχύει τη μεταφραστική εγκυρότητα εξαλείφοντας τις διαφορές μεταξύ ειδών. Η εργασία αυτή προάγει την κατανόηση της βιολογίας των αστροκυττάρων, αποδεικνύοντας ότι η χρονική δυναμική της σηματοδότησης των GCs αποτελεί κύριο καθοριστικό παράγοντα των φλεγμονωδών αποκρίσεών τους και των προσαρμοστικών μηχανισμών τους. Τα ευρήματα αμφισβητούν τα παραδοσιακά παραδείγματα δοσοεξαρτώμενης δράσης των GCs και αποδεικνύουν ότι η φυσιολογική παλμικότητα διατηρεί αντιφλεγμονώδεις φαινότυπους, ενώ τα μη φυσιολογικά πρότυπα χορήγησης προκαλούν παθολογική ενεργοποίηση. Η αναγνώριση αυτο-ρυθμιζόμενων μηχανισμών φλεγμονής και ο χρονικός τους συντονισμός προσφέρουν νέες γνώσεις για την ομοιοστατική πλαστικότητα των αστροκυττάρων. Οι ανακαλύψεις αυτές συμβάλλουν στο αναδυόμενο παράδειγμα της εξατομικευμένης ιατρικής και χρονοθεραπείας, παρέχοντας μηχανιστικά στοιχεία ότι οι ατομικές διαφορές στη ρυθμικότητα της κορτιζόλης μπορεί να απαιτούν εξατομικευμένες θεραπευτικές προσεγγίσεις. Η παρούσα μελέτη θεμελιώνει ένα μεθοδολογικό πλαίσιο για τη διερεύνηση των επιδράσεων της χρονικής χορήγησης φαρμάκων και ανοίγει τον δρόμο για την ανάπτυξη χρονοβιολογικά ενημερωμένων θεραπευτικών πρωτοκόλλων που μεγιστοποιούν την αποτελεσματικότητα και ελαχιστοποιούν τις ανεπιθύμητες ενέργειες. Τα αποτελέσματα αυτά θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν φαρμακολογικά στο πλαίσιο νευρολογικών διαταραχών που χαρακτηρίζονται από χρόνια νευροφλεγμονή, όπως η νόσος Alzheimer και η μείζων καταθλιπτική διαταραχή, καθοδηγώντας την ανάπτυξη παρεμβάσεων βασισμένων σε GCs που αποκαθιστούν τους φυσιολογικούς υπερκιρκάδιους ρυθμούς αντί να βασίζονται σε συνεχή ή μοναδική ημερήσια χορήγηση. Τέτοιες χρονοθεραπευτικές στρατηγικές μπορεί να βελτιώσουν την θεραπευτική ανταπόκριση, να περιορίσουν επιβλαβή φλεγμονώδη σηματοδότηση και να διατηρήσουν τη φυσιολογική αστροκυτταρική λειτουργία που διαταράσσεται σε αυτές τις καταστάσεις. Συμπερασματικά, η χρονική ακρίβεια της ρύθμισης των GCs αντιπροσωπεύει μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για την ενίσχυση της αποτελεσματικότητας των φαρμάκων, ελαχιστοποιώντας παράλληλα μακροπρόθεσμες ανεπιθύμητες επιπτώσεις σε ευάλωτους πληθυσμούς ασθενών.