Μελέτη του ρόλου του σιδήρου και αξιολόγηση της προστατευτικής ικανότητας σιδηροδεσμευτικών σκευασμάτων με διαφορετική λιποφιλικότητα στην ηπατική βλάβη από ισχαιμία-επαναιμάτωση: πειραματική μελέτη

Abstract

Ischemia and reperfusion (I/R) injury has been defined as the aggravation of cellular dysfunction and death following the reestablishment of blood flow to previously ischemic tissues. Although reperfusion is vital for salvaging ischemic tissues, paradoxically, it also exacerbates tissue injury, depending on the duration and extension of the ischemic event. The reperfusion phase can be divided into the early (<4 h) and the late (4–48 h) reperfusion phase. Tissue injury occurs in both the early and the late phases, but is more severe in the latter. The reperfusion-induced injury occurs in different organs and a wide range of disorders, including myocardial infarction, cerebrovascular disease, hemorrhagic shock, liver resections, trauma and transplantation. Oxidative stress caused by the elevated production of reactive oxygen species (ROS) during reperfusion, represents the critical cause for the development of I/R injury. During the first few minutes of reperfusion, a burst of ROS generation fueled by the reintroduction of oxygen to the previously ischemic tissue occurs, causing tissue injury. ROS include both moderately reactive oxidants (such as O2•- and H2O2) and extremely reactive ones (such as HO•). A necessary requirement for the generation of extremely reactive free radicals is the presence of available labile iron, which acts as a catalyst to convert H2O2 to HO•. This free radical is the most powerful oxidant generated in vivo and provokes uncontrolled oxidations to all basic cellular constituents causing apparent tissue injury. This potential role of iron has been associated with a recently appreciated specific type of iron-dependent cell death, named “ferroptosis”, which invariably accompanies I/R injury. Considering the above, pharmacological interventions that diminish intracellular labile iron during reperfusion could be an alternative effective strategy to protect against the subsequent tissue injury. Tissue labile iron level can be modulated relatively easy by pharmacological means, using exogenous administration of appropriate iron chelating agents. The effectiveness of such drugs depends primarily on their accessibility to the cell interior at the right time and the right concentration. Iron chelating agents have been shown to be very effective in protecting cultured cells against oxidative stress-induced damage and against I/R injury. Based on the above considerations, we hypothesized that the combination of iron-chelating agents of different lipophilicity and iron-binding capacity could increase the possibility to be protective compared to single agents alone. We selected two widely used iron chelating drugs, namely desferrioxamine (DFO) and deferiprone (DFP). The DFO-iron complexes are kinetically favored compared to DFP-iron ones. At the same time, DFP exhibits higher lipophilicity and lower molecular weight and is therefore more capable to penetrate through cell membranes and chelate intracellular labile iron. The contribution of DFO in this system is to abstract iron from DFP-iron complexes in the extracellular space, ultimately acting as a safe sink for available iron.We initially examined whether the combination of the two drugs could offer enhanced protection in cultures of hepatic cells which were exposed to oxidative stress conditions. Our results showed that DFP induced a concentration-dependent decrease in labile iron levels and protected against oxidative stress-induced DNA damage. On the contrary, DFO did not affect iron levels, neither offered any protection to DNA, except when used in a high concentration and long incubation time. Finally, the two drugs in combination showed enhanced protection against DNA damage, compared to the protection offered by DFP alone. Based on these findings, we further performed in vivo experiments in rabbits subjected to partial hepatic ischemia followed by reperfusion. In order to conduct the in vivo part of the experiment and study the late phase of I/R injury, we standardised and described an anaesthetic model of general anaesthesia with endotracheal intubation, followed by recovery of the rabbits, which was applied in the study of the late phase of liver I/R with 24-h follow-up. Animals were subjected to 45 minutes of partial (70%) hepatic ischemia and 24 hours of reperfusion. The above anesthetic model offered hemodynamical and metabolic stability, easy recovery and survival of the animals at 24 hours after reperfusion. We observed in the in vivo part of the experiment that, in accordance with the in vitro experiments pre-treatment of the animals with the combination of the two drugs attenuated I/R-induced hepatic injury. In particular, histological analysis revealed significant protection against hepatocellular injury, while key biochemical markers of hepatic injury (ALT and AST activity) in serum showed a trend to decrease. In addition, the study included an ex vivo part, where liver grafts were subjected to cold ischemia and subsequently to subnormothermic mechanical perfusion with or without the two iron-chelating drugs or their combination. Although the combination of the two agents showed a tendency to liver injury protection, the results were not statistically significant. Both the in vivo and ex vivo experiments included an extra group of animals that were subjected to preconditioning with iron administration intraperitoneally every other day for 10 days. The results were contradictory. Iron-preconditioning showed no protection against warm I/R injury in vivo, but a tendency to protect against cold ischemia and reoxygenation.

Ως βλάβη από ισχαιμία και επαναιμάτωση (I/R injury) ορίζεται η επιδείνωση της κυτταρικής λειτουργίας και ο κυτταρικός θάνατος μετά από επανεγκατάσταση της αιματικής ροής σε έναν προηγουμένως ισχαιμικό ιστό. Παρόλο που η επαναιμάτωση/επανοξυγόνωση είναι απαραίτητη για τη διάσωση των ίσχαιμων ιστών, παραδόξως επιδεινώνει την ιστική βλάβη και η επιδείνωση αυτή εξαρτάται από τη διάρκεια και την έκταση της ισχαιμίας. Η περίοδος της επαναιμάτωσης χωρίζεται σε δύο φάσεις, την πρώιμη (<4 ώρες) και την όψιμη (4-48 ώρες). Ιστική βλάβη προκύπτει τόσο στην πρώιμη όσο και στην όψιμη φάση, αλλά είναι σοβαρότερη στην τελευταία. Η βλάβη από ισχαιμία και επαναιμάτωση συναντάται σε διάφορα όργανα και σε ένα ευρύ φάσμα διαταραχών, όπως το έμφραγμα του μυοκαρδίου, νόσοι των αγγείων του εγκεφάλου, η αιμορραγική καταπληξία, οι ηπατεκτομές, το τραύμα και οι μεταμοσχεύσεις οργάνων. Κύριο και κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη της βλάβης από I/R παίζει το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από την αύξηση της παραγωγής Δραστικών Μορφών Οξυγόνου (ΔΜΟ) κατά την επαναιμάτωση. Η βλάβη προκύπτει από έκρηξη παραγωγής ΔΜΟ που πυροδοτείται από την επανείσοδο οξυγόνου στον προηγουμένως ίσχαιμο ιστό κατά τη διάρκεια των λίγων πρώτων λεπτών της επαναιμάτωσης. Οι ΔΜΟ περιλαμβάνουν ενώσεις τόσο μέτριας (όπως το O2•- και το H2O2) όσο και εξαιρετικά υψηλής (όπως η HO•) δραστικότητας. Απαραίτητη προϋπόθεση για την παραγωγή αυτών των εξαιρετικά δραστικών ελεύθερων ριζών είναι η παρουσία ασταθούς σιδήρου, ο οποίος δρα ως καταλύτης για την μετατροπή του H2O2 σε HO•. Η HO• (ρίζα του υδροξυλίου) είναι ο πιο δραστικός οξειδωτικός παράγοντας που παράγεται in vivo και προκαλεί ανεξέλεγκτες οξειδώσεις σε όλα τα βασικά κυτταρικά συστατικά οδηγώντας σε ιστική βλάβη. Ο ρόλος αυτός του σιδήρου έχει συσχετισθεί και με ένα τύπο σιδηροεξαρτώμενου κυτταρικού θανάτου, την φερρόπτωση, που έχει περιγραφεί πρόσφατα και συνοδεύει κατά κανόνα την βλάβη από I/R. Παίρνοντας υπόψιν όλα τα παραπάνω, φαρμακευτική παρέμβαση που στοχεύει στην μείωση των επιπέδων του ενδοκυττάριου ασταθούς σιδήρου κατά την επαναιμάτωση μπορεί να αποτελέσει εναλλακτική και αποτελεσματική στρατηγική προστασίας έναντι της επακόλουθης ιστικής βλάβης. Τα επίπεδα του ασταθούς ή οξειδοαναγωγικά ενεργού σιδήρου μπορούν να τροποποιηθούν σχετικά εύκολα φαρμακολογικά με την εξωγενή χορήγηση των κατάλληλων σιδηροδεσμευτικών παραγόντων. Η αποτελεσματικότητα αυτών των φαρμάκων εξαρτάται πρωτίστως από την ικανότητας πρόσβασής τους στον ενδοκυττάριο χώρο στον κατάλληλο χρόνο και την κατάλληλη συγκέντρωση. Τα σιδηροδεσμευτικά φάρμακα έχει περιγραφεί να είναι αποτελεσματικά στην προστασία κυτταρικών καλλιεργειών έναντι βλάβης από οξειδωτικό στρες, καθώς και έναντι βλάβης από I/R. Βασιζόμενοι στα παραπάνω δεδομένα, υποθέσαμε πως ο συνδυασμός δύο σιδηροδεσμευτικών παραγόντων με διαφορετική λιποφιλικότητα και ικανότητα σύνδεσης με τον σίδηρο είναι πιθανά πιο προστατευτικός σε σύγκριση με τον κάθε παράγοντα μεμονωμένα. Επιλέξαμε δύο ευρέως χρησιμοποιούμενα σιδηροδεσμευτικά φάρμακα, τη δεσφερριοξαμίνη (DFO) και τη δεφεριπρόνη (DFP). Τα συμπλέγματα της DFO με τον σίδηρο (Fe) ευνοούνται κινητικά σε σύγκριση με τα συμπλέγματα DFP-Fe. Παράλληλα, η DFP διαθέτει υψηλή λιποφιλικότητα και χαμηλό μοριακό βάρος και έτσι είναι ικανή να διέρχεται διαμέσου κυτταρικών μεμβρανών και να δεσμεύει τον ασταθή ενδοκυττάριο σίδηρο. Η συμβολή της DFO σε αυτό το πλαίσιο έγκειται στην απόσπαση του Fe από τα συμπλέγματα DFP-Fe στον εξωκυττάριο χώρο, ενεργώντας έτσι τελικά ως μια ασφαλής δεξαμενή θωράκισης του διαθέσιμου σιδήρου. Αρχικά, εξετάσαμε αν ο συνδυασμός των δύο φαρμάκων μπορεί να προσφέρει ενισχυμένη προστασία σε καλλιέργειες ηπατοκυττάρων που θα εκτίθονταν σε συνθήκες οξειδωτικού στρες. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως η DFP οδηγούσε σε δοσοεξαρτώμενη μείωση των επιπέδων του ασταθούς σιδήρου και προστάτευε έναντι της οξειδωτικής βλάβης του DNA. Αντιθέτως, η DFO δεν επηρέαζε σημαντικά τα επίπεδα του σιδήρου, ούτε προσέφερε προστασία στο DNA, εκτός και αν χορηγούνταν σε υψηλές συγκεντρώσεις και παρατεταμένο χρόνο επώασης. Τέλος, ο συνδυασμός των δύο φαρμάκων έδειξε ενισχυμένη προστασία έναντι της βλάβης του DNA σε σύγκριση με την προστασία που προσέφερε η DFP μόνη της. Βασιζόμενοι σε αυτά τα ευρήματα, προχωρήσαμε στη διενέργεια in vivo πειράματος σε κονίκλους που υποβλήθηκαν σε μερική ηπατική ισχαιμία ακολουθούμενη από επαναιμάτωση. Προκειμένου να διεξαχθεί το in vivo μέρος του πειράματος και η μελέτης της όψιμης φάσης της βλάβης από I/R προτυποποιήσαμε και περιγράψαμε στη βιβλιογραφία αναισθησιολογικό μοντέλο γενικής αναισθησίας με ενδοτραχειακή διασωλήνωση ακολουθούμενο από ανάνηψη των κονίκλων που εφαρμόστηκε για τη μελέτη της όψιμης φάσης της I/R του ήπατος με παρακολούθηση για 24 ώρες. Τα ζώα υποβλήθηκαν σε 45 λεπτά μερικής (70%) ηπατικής ισχαιμίας και 24 ώρες επαναιμάτωσης. Το μοντέλο αυτό αναισθησίας προσέφερε αιμοδυναμική και μεταβολική σταθερότητα, εύκολη ανάνηψη και επιβίωση των ζώων μέχρι τις 24 ώρες μετά την επαναιμάτωση. Παρατηρήσαμε στο in vivo πείραμα πως, σε συμφωνία με το in vitro πείραμα, η χορήγηση του συνδυασμού των φαρμάκων πριν την πρόκληση της ισχαιμίας μείωνε την βλάβη από I/R. Πιο συγκεκριμένα, η ιστολογική ανάλυση αποκάλυψε σημαντική προστασία έναντι της ηπατοκυτταρικής βλάβης, ενώ οι βιοχημικοί δείκτες ηπατικής βλάβης (επίπεδα ALT και AST) στον ορό έδειξαν τάση μείωσης.Επιπρόσθετα, η μελέτη περιλάμβανε πείραμα ex vivo, στο οποίο ηπατικά μοσχεύματα υποβλήθηκαν σε ψυχρή ισχαιμία και ακολούθως σε υπο-νορμοθερμική μηχανική κυκλοφορία με ή χωρίς τους δύο σιδηροδεσμευτικούς παράγοντες ή τον συνδυασμός τους. Παρόλο που ο συνδυασμός των δύο φαρμάκων έδειξε τάση προστασίας έναντι της ηπατικής βλάβης, τα αποτελέσματα δεν ήταν στατιστικά σημαντικά.Τόσο το in vivo όσο και το ex vivo μέρος του πειράματος περιλάμβαναν μία επιπλέον ομάδα ζώων, η οποία είχε υποβληθεί σε προετοιμασία με χορήγηση σιδήρου ενδοπεριτοναϊκά μέρα παρ’ ημέρα για 10 ημέρες. Τα αποτελέσματα ήταν αντικρουόμενα. Η προετοιμασία με σίδηρο δεν έδειξε προστατευτική ικανότητα έναντι της βλάβης από θερμή I/R in vivo, αλλά έδειξε τάση προστασίας έναντι της βλάβης από ψυχρή ισχαιμία και επανοξυγόνωση ex vivo.