A study of the immune system in patients with chronic kidney disease and kidney transplant recipients: correlations with markers of cardiovascular disease

Abstract

Cardiac remodeling is a hallmark of chronic kidney disease (CKD) manifesting as myocardial fibrosis, left ventricular hypertrophy (LVH), impaired myocardial strain and eventually left ventricular diastolic and systolic dysfunction. Kidney transplantation is associated with significant improvements in left ventricular size and function, as well as regression of LVH, otherwise known as reverse remodeling. Nevertheless, subclinical abnormalities in the biventricular strain may be observed in kidney transplant recipients (KTRs) even when other classical indices of myocardial function such as ejection fraction (EF) are normal. Maladaptive activation of the immune system plays an essential role in the pathogenesis of CKD and cardiovascular disease (CVD). The role of immune system components in the development of myocardial remodeling in CKD and kidney transplantation remains an open question. Likewise, little evidence has been generated until now regarding potential alterations of the cellular components of the immune system in patients with CKD due to heart failure, as occurs in type 2 cardiorenal syndrome (CRS-2). We therefore conducted a cross-sectional study in a cohort of non-end-stage CKD patients and KTRs without established CVD to investigate for the first time the relation of a selected panel of immune cell subpopulations in the peripheral circulation with classical and novel, strain-related indices of myocardial performance as evaluated by two-dimensional STE. In addition, we investigated the expression of a selected panel of immune cell subsets in the peripheral blood of a cohort of CRS-2 patients and subsequently made comparisons to a group of patients with CKD but without established CVD matched for gender and estimated glomerular filtration rate (eGFR). We further examined the clinical correlations as well as the prognostic value of specific immune cells with respect to overall and cardiovascular mortality in patients with type CRS-2. There were enrolled 44 consecutive patients with CKD and without established CVD, who were under regular follow-up by our outpatient nephrology clinic and 38 KTRs without established CVD who were under follow-up by the kidney transplant unit of our hospital as well as 39 stable male patients with CRS-2 under regular follow-up by the outpatient chronic heart failure and CKD clinic of our hospital. After baseline evaluation, patients with CRS-2 were followed until the end of the established observation period, or the study endpoint was reached, which was defined as a combined outcome of all-cause mortality and cardiovascular mortality.The peripheral blood immune cell subsets analysis was performed by flow cytometry. Accordingly, CD14++CD16-, CD14++CD16+, and CD14+CD16++ percentage and the absolute number of cells out of the total monocytes, as well as NK cells (CD3+CD16+56+), CD3- CD19+ B-lymphocytes, CD3+ CD4+ T cells, CD3+CD8+ T cells, and T regulatory cells (Tregs) (CD4+CD25+ FoxP3+) absolute values, and percentage out of the total lymphocytes were measured. Anthropometric and clinical data were recorded at baseline by patients’ medicalrecords, including comorbidities such as the presence of diabetes mellitus (DM) and medications. In addition, common biochemical parameters were measured at baseline in accordance with standard methods applied in the hospital laboratory. Echocardiographic data from ultrasounds performed by a skilled operator within 1 month from immune cell subset analysis were recorded, including parameters for estimating ventricular function and morphology and for cardiac chamber quantification. Specifically, regarding CKD patients and KTRs, classical and novel strain-related indices of ventricular function were measured by speckle-tracking echocardiography at baseline and following dipyridamole infusion. Two-dimensional STE analysis included assessment of global longitudinal strain (GLS), global radial strain (GRS) and global circumferential strain (GCS). In addition, left ventricular twist and untwist rates were measured. Following the baseline echocardiographic evaluation, dipyridamole was administered, and a new echocardiographic assessment was performed. The differences (Δ) between the values of measured echocardiographic parameters post and prior to dipyridamole infusion were calculated. Following adjustment for confounders including age, eGFR and UPCR, the differences in immune cell subsets between CKD patients and KTRs remained statistically significant for the percentage of classical monocytes (p =0.02, both the number and percentage of non-classical monocytes (p < 0.001), the percentage of T-lymphocytes and B lymphocytes (p = 0.03 and p = 0.003, respectively) as well as the Tregs number (p = 0.008). Following univariate regression analysis, the differences in immune cell subsets between patients with CRS-2 and CKD patients remained statistically significant for CD14++CD16+ monocytes, total lymphocytes, and NK cells (p < 0.05 for all) but not for Tregs, after adjustment for various confounders including age. Interestingly, we found increased levels of proinflammatory intermediate CD14++CD16+ monocytes in CRS-2 patients as compared to CKD patients, albeit no significant differences were detected between other robust markers of inflammation, such as CRP or ESR between the two cohorts. Our results showed lower levels of NK cells in patients with CRS-2 compared to their CKD counterparts as well as in CRS-2 patients with chronic atrial fibrillation compared to those without. In CKD patients, a direct association of RWT, a measure of left ventricular concentricity broadly used as an index of LVH with CD14++CD16− monocytes count (β = 0.447, p = 0.004) was found, whereas the correlation with arterial hypertension was lost at multivariate analysis. Furthermore, in KTR, the classical CD14++CD16− monocytes count was inversely associated with improvements in systolic wall motion indices, such as the medial and lateral wall systolic velocity of the left ventricle (Sl and Sm) (β = −0.516, p = 0.01 and β = −0.707, p < 0.001, respectively). An interesting finding of the study is the trend of independent correlations between the intermediate CD14++CD16+ monocytes with strain-related left ventricular myocardial performance indices, both in CKD patients and in KTRs. Thus, the CD14++CD16+ monocyteswere independently associated with higher baseline GRS values in CKD patients, whereasin KTRs, they were associated with better baseline left ventricular twist (β = 0.416, p = 0.01) and untwist parameters (β = −0.742, p = 0.09). About our results, another potential explanation, though speculative, would be that a compensatory augmentation in strain-related myocardial performance indices is promoted in the setting of the microinflammatory milieu of CKD, which would subsequently lead to myocardial damage and remodeling. The results are thought provoking and merit additional research considering the complex properties of the pro-inflammatory CD14++CD16+ monocytes in the pathogenesis of myocardial remodeling in CKD and following kidney transplantation. It is worth mentioning that among our patients, KTRs displayed a higher classical CD14++CD16− monocytes count together with a lower level of pro-inflammatory CD14++CD16+ monocytes compared to the CKD patients, which is in line with data from previous studies. A negative correlation was found between CD4+ T-cells with left ventricular EF in CKD patients (β = −0.431, p = 0.009) as well as with the dipyridamole induced improvement of left ventricular EF in KTRs (β = −0.378, p = 0.02). Likewise, in KTRs we found a negative correlation of CD4+ T-cells both with MAPSE (β = −0.463, p = 0.04), a sensitive marker of early systolic dysfunction and TAPSE, a marker of right ventricular function, although the latter was lost following multivariate analysis. In accord with the above, about strain-related indices of left ventricular function, CD4+ T-cells were inversely correlated with dipyridamole induced improvements in GLS in KTRs (β = 0.403, p = 0.01). Further characterization of the CD4+ T-cell responses is needed in order to discern possible pathogenic links to the development of uremic cardiomyopathy, evaluate their role as novel biomarkers of disease and subsequently examine the effects of immunomodulation on the CKD-related myocardial remodeling.An independent association of CD8+ T-cells with both left ventricular twist and untwist in patients with CKD was found (β = 0.405, p = 0.02 and β = −0.363, p = 0.03 respectively). Considering the differences in the pathogenic models implemented by the above studies as well as the preliminary nature of our results, it remains to be determined whether CD8+ T-cells are simple bystanders or active and independent players in the mechanisms of CKD-related myocardial dysfunction. Interestingly, we detected an independent correlation of NK cells both with E/A ratio (β = −0.387, p = 0.02) as well as with GLS (β = −0.362, p = 0.01) in KTRs only. These results appear controversial at first sight considering that a physiological reduction in E/A ratio is observed with aging, whereas the relationship of this index with left ventricular diastolic function is more complex and should be evaluated in combination with other markers, including the E/E’ ratio. On the other hand, we also found that higher NK cell counts were associated with improved left ventricular strain in KTRs. Results of the prospective arm of the study regarding patients with CRS-2 showed that during a median follow-up of 29.8 ±3.4 months, 23 CRS-2 patients (59%) reached the study endpoint with no patients being lost to follow-up. At binary logistic regression analysis, immune cell subpopulations that correlated with all-cause and cardiovascular death included total lymphocyte counts, (OR 0.85 per 100 cells/μL increase; 95% CI 0.75–0.97; p = 0.01), T-cell number (OR 0.82 per 100 cells/μL increase; 95% CI 0.70–0.96; p = 0.01), CD4+ T-lymphocyte number (OR 0.66 per 100 cells/μL increase; 95% CI 0.50–0.87; p = 0.004), CD8+ T-lymphocyte counts below their median value cut-off of 410/μL (OR 4.67; 95% CI 1.14–19.07; p = 0.03), Treg counts below their median value cut-off of 35/μL (OR 6.63; 95% CI 1.36–23.27; p = 0.01), and CD14++CD16+ monocyte counts above their median cut-off value of 40/μL (OR 4.13; 95% CI 1.06–16.1; p = 0.04). In a multivariate model including all six immune cell subsets, only the CD4+ T-lymphocytes remained independent predictors of mortality (OR 0.66; 95% CI 0.50–0.87; p = 0.004). In contrast, no such associations were found for age, eGFR, UPCR, hsTnI, BNP, as well as the rest of the clinical or laboratory indices. Subsequently, Kaplan–Meier survival curves for CRS-2 patients according to the levels of immune cell subpopulations (i.e., below vs. above median value) were generated. Decreased levels of lymphocytes, T-lymphocytes, CD4+ T-cells, CD8+ T-cells, and Tregs were associated with mortality at a median follow-up of 30 months (p < 0.05 for all log-rank tests). Increased levels of proinflammatory intermediate CD14++CD16+ monocyte counts showed a trend for increased mortality (p = 0.093). Overall, this study provides preliminary but noteworthy evidence regarding the independent associations of immune cell subsets, including classical CD14++CD16 and intermediate CD14++CD16+ monocytes, NK cells and lymphocytes subsets independently correlate with subclinical indices of myocardial dysfunction, including left ventricular strain and torsion-related parameters, in patients with CKD and in KTRs without established CVD. Taking into consideration that subtle alterations in left ventricular function commence early in CKD, these findings provide novel insights suggesting a potential role for specific immune cell phenotypes for CKD-related cardiomyopathy. Notably, the CD4+ T-lymphocytes were shown to independently predict fatal cardiovascular events in patients with CRS-2. Furthermore, the study results showed that patients with CRS-2 exhibit alterations of the immune cell subsets profile in the circulation compared to CKD patients of similar kidney function but without established cardiovascular disease, thus indicating that distinct immune mechanisms might be involved in the pathogenesis or during the chronic clinical course of CKD in the setting of heart failure as compared to CKD without established CVD.

Η δυσπροσάρμοστη ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος φαίνεται να παίζει ουσιαστικό ρόλο στη παθογένεια της ΧΝΝ και των καρδιαγγειακών παθήσεων. Ο ρόλος των συστατικών του ανοσοποιητικού συστήματος στην παθογένεια του remodeling του μυοκαρδίου στη ΧΝΝ και μετά τη μεταμόσχευση νεφρού, παραμένει αδιευκρίνιστος. Τα δεδομένα σχετικά με τις πιθανές μεταβολές και διαταραχές των κυτταρικών στοιχείων του ανοσοποιητικού συστήματος στους ασθενείς με ΧΝΝ σε έδαφος καρδιακής ανεπάρκειας, δηλαδή με καρδιονεφρικό σύνδρομο τύπου 2 (ΚΝΣ-2) παραμένουν ελάχιστα μέχρι τώρα. Με βάση τα παραπάνω πραγματοποιήθηκε διαστρωματική μελέτη σε μια κοορτή ασθενών με ΧΝΝ χωρίς εγκατεστημένη καρδιαγγειακή νόσο και παρομοίως σε μια κοορτή ληπτων νεφρικού μοσχεύματος (ΛΝΜ) χωρίς εγκατεστημένη καρδιαγγειακή νόσο, με στόχο την διερεύνηση για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία των πιθανών συσχετίσεων ενός επιλεγμένου πάνελ υπό-πληθυσμών ανοσοκυττάρων στο περιφερικό αίμα, με κλασσικούς και νεότερους δείκτες λειτουργίας του μυοκαρδίου, συμπεριλαμβάνοντας τους δείκτες παραμόρφωσης της αριστερής κοιλίας, μέσω δισδιάστατης ηχοκαρδιογραφίας «speckle tracking”. Επιπλέον, εξετάστηκαν οι πιθανές διαφορές στην έκφραση των ανοσοκυττάρων μεταξύ των ασθενών με ΧΝΝ και των ΛΝΜ. Διερευνήθηκε η έκφραση του επιλεγμένου πάνελ των ανοσοκυττάρων στο περιφερικό αίμα σε μια κοορτή ασθενών με ΚΝΣ-2 καθώς και έγιναν συγκρίσεις με μια ομάδα ασθενών με ΧΝΝ, χωρίς εγκατεστημένη καρδιαγγειακή νόσο, εξομοιωμένων ως προς το φύλο και το ρυθμό σπειραματικής διήθησης (eGFR). Επιπλέον, διερευνήθηκαν οι πιθανές κλινικό-εργαστηριακές συσχετίσεις των ανοσοκυττάρων στις ομάδες των ασθενών. Το προοπτικό σκέλος της μελέτης είχε ως κύριο στόχο τη διερεύνηση για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία της προγνωστικής άξιας των υπότυπων των ανοσοκυττάρων με καταληκτικό συνδυαστικό σημείο την ολική ή καρδιαγγειακή θνητότητα στους ασθενείς με ΚΝΣ-2. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε προοπτική ανάλυση των υποτύπων των ανοσοκυττάρων στο περιφερικό αίμα των ασθενών με ΧΝΝ και των ΛΝΜ σε δυο χρόνους (αρχική ανάλυση- Τ0 και μετά από 24 μήνες – Τ1) ενώ διερευνήθηκαν και πιθανές κλινικές συσχετίσεις. Στη μελέτη συμπεριλήφθησαν 44 ασθενείς με ΧΝΝ και χωρίς εγκατεστημένη καρδιαγγειακή νόσο, 38 ΛΝΜ χωρίς εγκατεστημένη καρδιαγγειακή νόσο, 39 ασθενείς με ΚΝΣ-2 καθως και 10 υγιή άτομα. Η ανάλυση των υπότυπων των ανοσοκυττάρων στο περιφερικό αίμα διενεργήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Μετρήθηκαν το ποσοστό των CD14++CD16-, CD14++CD16+, and CD14+CD16++ μονοκυττάρων επί των ολικών μονοκυττάρων καθώς και ο απόλυτος αριθμός των υπότυπων των μονοκυττάρων. Επίσης, μετρήθηκαν το ποσοστό των NK κυττάρων (CD3+CD16+56+), CD3- CD19+ B-λεμφοκυττάρων, CD3+ CD4+ T λεμφοκυττάρων, CD3+CD8+ T λεμφοκυττάρων, and T ρυθμιστικών κυττάρων (Tregs) (CD4+CD25+ FoxP3+) επί των ολικών λεμφοκυττάρων καθώς και ο απόλυτος αριθμός τους. Τα ανθρωπομετρικά και τα κλινικά δεδομένα καταγράφηκαν από τους κλινικούς φακέλους των ασθενών, συμπεριλαμβανομένων των συνοσηροτήτων και της φαρμακευτικής αγωγής ενώ συγχρόνως μετρήθηκαν κλασσικοί εργαστηριακοί δείκτες. Τα υπερηχοκαρδιογραφικά δεδομένα, αντλήθηκαν από υπερήχους καρδιάς που διενεργήθηκαν εντός ενός μήνα από τη μέτρηση των υπότυπων των ανοσοκυττάρων. Ειδικά, όσον αφορά τους ασθενείς με ΧΝΝ και τους ΛΝΜ, μετρήθηκαν οι κλασσικοί και οι νεότεροι δείκτες παραμόρφωσης της αριστερής κοιλίας, συμπεριλαμβανομένων των επιμήκες (GLS), ακτινικό (GRS) και κυκλοτερές (GCS) strain, twist και untwist, με «speckle-tracking» υπερηχοκαρδιογραφήμα στην αρχική φάση και μετά τη χορήγηση διπυριδαμόλης (DIPSE). Επίσης, υπολογίστηκαν οι διαφορές (Δ) μεταξύ των τιμών των υπερηχοκαρδιογραφικών παραμέτρων μετά και πριν τη χορήγηση διπυριδαμόλης. Τα αποτελέσματα της μελέτης ως προς τις διαφορές των υπότυπων των ανοσοκυττάρων μεταξύ των υπό-ομάδων ανέδειξαν μετά από προσαρμογή για συγχυτικούς παράγοντες όπως ηλικία, eGFR και πρωτεινουρία (UPCR), πως οι ΛΝΜ είχαν υψηλότερο ποσοστό κλασσικών μονοκυττάρων (p=0.02) και Τ-λεμφοκυτταρων (p=0.03) καθώς και χαμηλότερο αριθμό και ποσοστό των CD4+CD16++ μη-κλασσικών μονοκυττάρων (p<0.001), των B-λεμφοκυττάρων (p = 0.003) και των Tregs (p=0.008). Όσον αφορά τις διαφορές μεταξύ των ασθενών με ΚΝΣ-2 και των ασθενών με ΧΝΝ, μετά από μονομεταβλητή ανάλυση παλινδρόμησης και προσαρμογή για διάφορους συγχυτικούς παράγοντες, συμπεριλαμβάνοντας την ηλικία, φάνηκε πως οι ασθενείς με ΚΝΣ-2 είχαν υψηλοτέρα επίπεδα των προ-φλεγμονωδών CD14++CD16+ μονοκυττάρων καθώς και χαμηλότερα επίπεδα ολικών λεμφοκυττάρων και NK κυττάρων (p < 0.05 για όλα τα κύτταρα). Αξιοσημείωτο εύρημα είναι τα αυξημένα επίπεδα των προ-φλεγμονωδών ενδιάμεσων μονοκυττάρων στους ασθενείς με ΚΝΣ-2 σε σύγκριση με τους ασθενείς με ΧΝΝ, ενώ δεν διαπιστώθηκαν σημαντικές διαφορές ως προς τους υπόλοιπους κλασσικούς δείκτες φλεγμονής, όπως η CRP ή η ταχύτητα καθίζησης ερυθρών (ΤΚΕ) μεταξύ των δυο υπό-ομάδων. Επίσης τα αποτελέσματα ανέδειξαν χαμηλότερα επίπεδα των NK κυττάρων σε ασθενείς με ΚΝΣ-2 και με συνυπάρχουσα χρόνια κολπική μαρμαρυγή συγκριτικά με τους ασθενείς με ΚΝΣ-2 που δεν είχαν κολπική μαρμαρυγή. Όσον αφορά τις συσχετίσεις μεταξύ των υπότυπων των ανοσοκυττάρων με τους κλασσικούς και τους νεότερους δείκτες δυσλειτουργίας της αριστερής κοιλίας, στους ασθενείς με ΧΝΝ παρατηρήθηκε μια απευθείας ανεξάρτητη συσχέτιση του σχετικού πάχους της αριστερής κοιλίας (relative wall thickness – RWT), ένας δείκτης εκτίμησης του βαθμού συγκεντρικής υπερτροφίας της αριστερής κοιλίας, με τα κλασσικά CD14++CD16− μονοκύτταρα (β = 0.447, p = 0.004), ενώ η συσχέτιση με την αρτηριακή υπέρταση χάθηκε κατά την πολυπαραγοντική ανάλυση. Επίσης, στους ΛΝΜ, ο αριθμός των κλασσικών CD14++CD16− μονοκυττάρων ανέδειξε αντίστροφη συσχέτιση με τη βελτίωση των δεικτών συστολικής κινητικότητας των τοιχωμάτων της αριστερής κοιλίας, όπως οι medial and lateral wall systolic velocity (Sl and Sm), μετά τη χορήγηση διπυριδαμόλης, (β = −0.516, p = 0.01 and β = −0.707, p < 0.001, αντίστοιχα). Ένα άλλο ενδιαφέρον εύρημα της μελέτης αποτελεί η ανεύρεση ενός trend ανεξάρτητων συσχετίσεων μεταξύ των ενδιάμεσων, προ-φλεγμονωδών CD14++CD16+ μονοκυττάρων με τους δείκτες του μυοκαρδιακού strain στους ασθενείς με ΧΝΝ και στους ΛΝΜ. Συγκεκριμένα, τα CD14++CD16+ μονοκύτταρα ανέδειξαν ανεξάρτητη συσχέτιση με υψηλότερες τιμές του GRS στους ασθενείς με ΧΝΝ, ενώ στους ΛΝΜ συσχετίστηκαν άμεσα με καλύτερους δείκτες twist (β = 0.416, p = 0.01) και untwist (β = −0.742, p = 0.09). Μια πιθανή εξήγηση για τα αποτελέσματα της μελέτης, αν και υποθετική, θα ήταν πως η αντισταθμιστική αύξηση στους strain δείκτες επίδοσης του μυοκαρδίου, προωθείται σε έδαφος της χρόνιας προ-φλεγμονώδους εξεργασίας της ΧΝΝ, η οποία στη συνέχεια ωστόσο, θα οδηγούσε σε δεύτερο χρόνο σε βλάβη και remodeling του μυοκαρδίου. Τα αποτελέσματα αυτά διεγείρουν ερωτήματα ως προς τις πολύπλοκες ιδιότητες των προ-φλεγμονωδών CD14++CD16+ μονοκυττάρων και τη συμμετοχή τους στη παθογένεια του remodeling του μυοκαρδίου στη ΧΝΝ καθώς και μετά τη μεταμόσχευση νεφρού. Σχετικά με τους υπό-πληθυσμούς των λεμφοκυττάρων, αρνητική συσχέτιση ανευρέθηκε μεταξύ των CD4+ Τ-λεμφοκυττάρων και του κλάσματος εξωθήσεως της αριστερής κοιλίας (EF) (β = −0.431, p = 0.009) στους ασθενείς με ΧΝΝ, όπως και επίσης και με βελτιωμένες τιμές του EF μετά τη χορήγηση διπυριδαμόλης στους ΛΝΜ (β = −0.378, p = 0.02). Παρομοίως, στους ΛΝΜ, ανευρέθηκε αρνητική συσχέτιση των CD4+ Τ-λεμφοκυττάρων με τη παράμετρο MAPSE (β = −0.463, p = 0.04), έναν ευαίσθητο δείκτη πρώιμης συστολικής δυσλειτουργίας της αριστερής κοιλίας και τη παράμετρο TAPSE, δείκτης λειτουργίας της δεξιάς κοιλίας, αν και η συσχέτιση με την τελευταία παράμετρο χάθηκε κατά την πολυπαραγοντική ανάλυση. Σε συμφωνία με τα παραπάνω, όσον αφορά τους δείκτες strain της αριστερής κοιλίας στους ΛΝΜ, τα CD4+ T-λεμφοκύτταρα, ανέδειξαν αρνητική συσχέτιση με βελτιωμένες τιμές του GLS μετά τη χορήγηση διπυριδαμόλης (β = 0.403, p = 0.01). Δεδομένου των ανωτέρων ευρημάτων, απαιτείται περαιτέρω χαρακτηρισμός των απαντήσεων των CD4+ Τ-λεμφοκυττάρων ώστε να διευκρινιστούν πιθανές παθοφυσιολογικές συσχετίσεις με την ουραιμική μυοκαρδιοπάθεια, να αναλυθεί ο ρόλος τους ως πιθανοί βιοδείκτες της νόσου και στη συνέχεια να εκτιμηθεί η θεραπευτική επίδραση της ανοσοτροποποίησης στο remodeling του μυοκαρδίου στη ΧΝΝ. Όσον αφορά τα CD8+ T-λεμφοκύτταρα, ανευρέθηκαν ανεξάρτητες συσχετίσεις με το twist και το untwist της αριστερής κοιλίας στους ασθενείς με ΧΝΝ (β = 0.405, p = 0.02 and β = −0.363, p = 0.03 αντίστοιχα). Τα αποτελέσματα της προοπτικής μελέτης των ασθενών με ΚΝΣ-2 ανέδειξαν πως κατά τη διάρκεια μέσης παρακολούθησης 29.8 ±3.4 μηνών, 23 ασθενείς με ΚΝΣ-2 (59%) εκδήλωσαν το συνδυαστικό καταληκτικό σημείο της μελέτης. Κατά την ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης, οι υπό-πληθυσμοί των ανοσοκυττάρων που συσχετίστηκαν με την ολική ή καρδιαγγειακή θνητότητα ήταν τα ολικά λεμφοκύτταρα (OR 0.85 ανά 100 κύτταρα/μL αύξηση; 95% CI 0.75–0.97; p = 0.01), τα Τ-λεμφοκύτταρα (OR 0.82 ανά 100 κύτταρα/μL αύξηση; 95% CI 0.70–0.96; p = 0.01), τα CD4+ T-λεμφοκύτταρα (OR 0.66 ανά 100 κυτταρα/μL αύξηση; 95% CI 0.50–0.87; p = 0.004), τα CD8+ T-λεμφοκυττάρα χαμηλότερα του επιπέδου cut-off της διάμεσης τιμής των 410/μL (OR 4.67; 95% CI 1.14–19.07; p = 0.03), τα Tregs χαμηλοτερα του επιπέδου cut-off της διάμεσης τιμής των 35/μL (OR 6.63; 95% CI 1.36–23.27; p = 0.01) καθώς και τα CD14++CD16+ μονοκύτταρα άνω της διάμεσης τιμής cut-off των 40/μL (OR 4.13; 95% CI 1.06–16.1; p = 0.04). Το πολυπαραγοντικό μοντέλο ανάλυσης που συμπεριέλαβε και τους έξι υπό-πληθυσμούς των ανοσοκυττάρων, ανέδειξε μόνο τα CD4+ T-λεμφοκύτταρα να παραμένον ως ανεξάρτητοι προγνωστικοί παράγοντες της θνησιμότητας (OR 0.66; 95% CI 0.50–0.87; p = 0.004). Σε αντίθεση με τα παραπάνω, δεν ανευρέθηκαν συσχετισμοί μεταξύ της ηλικίας, του eGFR, του UPCR, της hsTnI, του BNP ή των υπολοίπων κλινικών και εργαστηριακών δεικτών με την ολική και την καρδιαγγειακή θνησιμότητα. Επίσης, για τους ασθενείς με ΚΝΣ-2 διενεργήθηκε ανάλυση επιβίωσης (καμπύλες Kaplan-Meier) ανάλογα με τα επίπεδα των υπό-πληθυσμών των ανοσοκυττάρων (ανώτερα η κατώτερα της διάμεσης τιμής τους). Μειωμένα επίπεδα των ολικών λεμφοκυττάρων, των Τ-λεμφοκυττάρων, των CD4+ Τ-λεμφοκυττάρων, των CD8+ Τ-λεμφοκυττάρων και των Tregs συσχετίστηκαν με τη θνησιμότητα κατά τη μέση παρακολούθηση των 30 μηνών (p < 0.05 για όλα τα log-rank τεστ). Από την άλλη, αυξημένα επίπεδα των προφλεγμονωδών ενδιάμεσων CD14++CD16+ μονοκυττάρων ανέδειξαν μια τάση για αυξημένη θνησιμότητα (p = 0.093). Η προοπτική παρακολουθηση των υποτύπων των ανοσοκυττάρων στο περιφερικό αίμα ΛΝΜ ανέδειξε κατά την ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης, ανεξάρτητη συσχέτιση των CD14++CD16+ μονοκυττάρων με μεταβολές του eGFR (β=0.338, p=0.04) και αντίστροφη συσχέτιση των CD8+ Τ-λεμφοκυττάρων με μεταβολές της πρωτενουρίας (β=–0.379, p=0.03). Συμπερασματικά, τα αποτέλεσμα της μελέτης προβάλλουν προκαταρκτικές ενδείξεις σχετικά με τις ανεξάρτητες συσχετίσεις μεταξύ των υπό-πληθυσμών των ανοσοκυττάρων, όπως τα κλασσικά CD14++CD16- μονοκύτταρα και τα ενδιάμεσα μονοκύτταρα, τα NK κύτταρα καθώς και τους υπότυπους των λεμφοκυττάρων, με τους υποκλινικούς δείκτες δυσλειτουργίας του μυοκαρδίου συμπεριλαμβάνοντας τους δείκτες παραμόρφωσης της αριστερής κοιλίας, σε ασθενείς με ΧΝΝ και ΛΝΜ χωρίς εγκατεστημένη καρδιαγγειακή νόσο. Λαμβάνοντας υπόψη πως ανεπαίσθητες μεταβολές της καρδιακής λειτουργίας εγκαθίστανται πρώιμα κατά την εξέλιξη της ΧΝΝ, τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης παρέχουν νέα δεδομένα τα οποία εισηγούνται πιθανό ρολό συγκεκριμένων ανοσοκυτταρικών φαινότυπων στη μυοκαρδιοπάθεια της ΧΝΝ. Επιπλέον, τα αποτελέσματα της μελέτης ανέδειξαν διαφορές ως προς την έκφραση των υπό-πληθυσμών των ανοσοκυττάρων μεταξύ των ασθενών με ΚΝΣ-2 και των ασθενών με ΧΝΝ χωρίς εγκατεστημένη καρδιαγγειακή νόσο, υποδεικνύοντας έτσι την εμπλοκή διαφορετικών ανοσολογικών μηχανισμών στην παθογένεια και στην εξέλιξη της ΧΝΝ σε έδαφος της καρδιακής ανεπάρκειας. Εν τέλει, η μελέτη ανέδειξε για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία το ρόλο συγκεκριμένων υπότυπων των ανοσοκυττάρων ως προγνωστικοί δείκτες έκβασης των ασθενών με ΚΝΣ-2.