Ένας νέος μηχανισμός που ρυθμίζει τον σχηματισμό της μιτωτικής ατράκτου σε κύτταρα ανθρώπου

Abstract

The mitotic spindle is a microtubule (MT)-based apparatus that is responsible for accurate segregation of chromosomes into two daughter cells. Microtubules are assembled from α and β-tubulin heterodimers, mainly organized by centrosomes (the main MT-organizing centers). Errors in spindle formation can lead to tumorigenesis or developmental disorders; however, the molecular mechanisms of mitotic spindle assembly are incompletely understood. In the present study, by confocal microscopy analysis, we show that, the DNA damage kinase Chk1 is essential for optimal density of spindle MTs in human cell lines. Chk1 phosphorylates β-tubulin in centrosomes, during prometaphase, at the conserved residue threonine 285 (T285) in vitro and in human cells. Furthermore, Chk1 inhibition or non-phosphorylatable mutation of T285 to alanine correlates with improper spindles, delayed anaphase onset, erroneous chromosome alignment and segregation, unequal daughter cell-size and reduced cell proliferation. On the other hand, expression of a phosphomimicking β-tubulin-T285E protein rescues mitotic spindle formation in Chk1-deficient cells. In addition, the serine/threonine kinase ATR and its partner proteins ATRIP and TopBP1, known for their role in upstream regulation of Chk1 in the DNA damage response, are essential for centrosomal localization of Chk1 in prometaphase and for optimal spindle formation. The ATR-interacting protein (ATRIP) promotes localization of ATR and TopBP1 to centrosomes during prometaphase. Furthermore, ATRIP interaction with ATR and TopBP1 is essential for Chk1 activation, β-tubulin-T285 phosphorylation in mitotic centrosomes and proper mitotic spindle formation. These findings identify a novel mechanism that safeguards genome integrity by promoting optimal spindle formation and function in human cells.

Η μιτωτική άτρακτος είναι ένα δυναμικό πολυμερές μικροσωληνίσκων (ΜΣ) απαραίτητο στην κυτταρική διαίρεση για το σωστό διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων στα δύο νέα θυγατρικά κύτταρα. Οι μικροσωληνίσκοι οργανώνονται κυρίως στα κεντροσώματα και αποτελούνται από ετεροδιμερή α και β-τουμπουλίνης. Λάθη στο σχηματισμό της ατράκτου οδηγούν σε αναπτυξιακές διαταραχές και καρκίνο, ωστόσο οι ακριβείς μηχανισμοί δημιουργίας της μιτωτικής ατράκτου δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Αρχικά, δείξαμε ότι η κινάση Chk1, η οποία έχει καλά μελετημένους ρόλους στην απόκριση του κυττάρου σε βλάβες του DNA, είναι απαραίτητη για τη βέλτιστη πυκνότητα και τον αποτελεσματικό πολυμερισμό των μικροσωληνίσκων της ατράκτου σε κύτταρα ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισμών, με συνεστιακή μικροσκοπία. Η Chk1 φωσφορυλιώνει τη β-τουμπουλίνη σε μία νέα συντηρημένη θέση, τη θρεονίνη 285 (Τ285) στα κεντροσώματα σε κυτταρα κατά την προμετάφαση. Αναστολή της Chk1 ή μη φωσφορυλιώσιμη μετάλλαξη της Τ285 σε αλανίνη σε πειράματα μείωσης-αντικατάστασης της ενδογενούς πρωτείνης, συσχετίζεται με λανθασμένες ατράκτους, καθυστερημένη έναρξη της ανάφασης, λάθη στη διάταξη και το διαχωρισμό των χρομωσωμάτων, δημιουργία θυγατρικών κυττάρων με άνισο μέγεθος, και μειωμένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Αντίθετα, έκφραση μιας φωσφομιμητικής β-τουμπουλίνης στην οποία η Τ285 έχει μεταλλαχθεί σε γλουταμικό οξύ, διασώζει το σχηματισμό και τις παραπάνω λειτουργίες της μιτωτικής ατράκτου σε κύτταρα χωρίς λειτουργική Chk1. Στη συνέχεια, βρήκαμε ότι οι πρωτεΐνες ATRIP, ATR και TopBP1, οι οποίες ρυθμίζουν την ενεργότητα της Chk1 παρουσία βλαβών στο DNA, εντοπίζονται στα μιτωτικά κεντροσώματα και είναι απαραίτητες για το σωστό σχηματισμό της μιτωτικής ατράκτου. Πιο συγκεκριμένα, δείξαμε ότι η πρωτεΐνη ATRIP επάγει τον εντοπισμό της κινάσης ATR στα μιτωτικά κεντροσώματα. Ακόμη, αλληλεπίδραση της ATRIP με τις πρωτείνες ATR και TopBP1 είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση της Chk1 και την φωσφορυλίωση της β-τουμπουλίνης στη Τ285 στα κεντροσώματα. Τα αποτελέσματα αυτά περιγράφουν ένα νέο σηματοδοτικό μονοπάτι στα κεντροσώματα των μιτωτικών κυτταρων, το οποίο επάγει το σχηματισμό της μιτωτικής ατράκτου, μέσω φωσφορυλίωσης της β-τουμπουλίνης στη θέση Τ285 από την Chk1.