Approaches on the acceptance criteria of dried blood spots based bioassays with the use of computational methods

Abstract

Dried Blood Spots (DBS) constitute a micro-sampling technique, in which a very small amount of capillary or venous blood is collected on specific, absorbent filter paper in the form of collection cards, which are then dried in room conditions. Usually, the collected blood originates from a finger or heel puncture (capillary blood), however, venous blood following a typical blood sampling may be used. The analysis is processed on a partial punch of fixed diameter (punch disk), taken from DBS via a specific puncher. Although this technique has a long history in bioanalysis, dating back centuries, the first application of DBSs for medical diagnostic purposes took place during the early 1960s, when Dr. Robert Guthrie introduced a simple test for measuring phenylalanine to detect the metabolic disorder phenylketonuria (PKU). Since that time, the utilization of DBS has been widely applied to bioanalytical assays, especially with mass spectrometric detectors, as a reliable alternative to traditional liquid biomatrices. This sampling method presents several advantages. Firstly, the technique is minimally invasive when capillary blood is used, and this fact enables DBS collection without the involvement of healthcare personnel. Sample collection and storage are easy and low cost and sample transportation is feasible without the application of specific conditions. For these reasons, DBS is nowadays widely utilized across various disciplines within life sciences and pharmaceutical research, including preclinical and clinical/pharmacokinetic trials, therapeutic drug monitoring (TDM), epidemiologic surveillance and metabolomic studies. Most importantly, this sampling approach has laid the groundwork for the initiation and expansion of neonatal screening programs globally, encompassing a wide array of biochemical and genetic analyses in this vulnerable population. Indeed, Newborn Screening (NBS) is a public health initiative conducted shortly after birth to identify specific genetic, metabolic and hormonal disorders, so-called inborn errors of metabolism (IEM). A large number of different genetic metabolic disorders exist (such as aminoacidopathies, organic acidemias, fatty acid disorders, urea circle disorders, endocrine disorders and hemoglobinopathies), varying in symptoms, treatment manifestations and disease courses. Consequently, the primary objective of NBS programs worldwide is to detect diseases early, enabling timely medical and pharmaceutical interventions to reduce morbidity and mortality during the neonatal and childhood stages. As a result, the development and expansion of NBS are regarded as key public health priorities in numerous countries. The introduction of comprehensive, population-wide NBS using tandem mass spectrometry (MS/MS) has led to broader screening panels, a significant increase in detectable disorders and the discovery of previously unrecognized diseases. Despite the many advantages associated with this alternative sampling strategy, several challenges still exist. Indeed, concerns regarding dried samples are often related to sample homogeneity, influence of the site of punching, consistency of filter paper performance and chromatographic effects. The correlation of venous and capillary blood concentrations of a given analyte is of course also of importance. However, the most debated issue is, without doubt, the so-called “hematocrit (Ht) effect’’. Ht is defined as the ratio of the volume of red blood cells to the total volume of blood. Reference interval(s) have not been defined for human Ht values, as these are dependent on several parameters, including age (neonates have higher and more variable Ht values), sex, race, nutritional status, pathological conditions (e.g. anemia, polycythemia, oncology and immunosuppressed patients) but also on other situations, such as pregnancy, smoking or residential elevation above sea level. Measured Ht values can, therefore, significantly vary between individuals and with different disease states. A different Ht leads, due to different viscosity, to different spot size, affecting assay bias. Blood viscosity is known to be impacted by Ht, which in turn affects how easily blood can spread onto DBS filter paper. As there is an increase in blood cells at high Ht levels, the blood becomes more viscous. Blood flux and diffusion characteristics on the filter paper collection device are affected due to viscosity variations, which can, therefore, have an impact on the size of the blood spots that are formed. A linear inverse relationship between DBS area and Ht value was proved following investigation of the relationship between decrease in DBS size with increasing Ht for different filter papers at a fixed volume of blood. All things considered, the Ht issue is a widely accepted pitfall in DBS analysis. The potential influence of Ht on DBS assay characteristics is well-studied, and, based on the above, it is acknowledged that, if the Ht values of the unknown blood samples vary significantly from Ht value of the calibration standards, this definitely influences assay bias; positive error for higher Ht values and negative for lower Ht values, when a punch of fixed diameter from DBS is utilized. Consequently, the increased variability in the assay performance, may sometimes, stand beyond the current applicable acceptance criteria for the total amount of bias for validated assays in regulated bioanalysis; in general, these acceptance criteria for accuracy of chromatographic assays are set at ±15% (% bias) and at ±20% for the Lower Limit of Quantification (LLOQ). Numerous factors influence how the Ht affects analyte quantitation in DBS samples, and this is mostly a problem when partial-DBS is applied. Various approaches (based on different instrumentation and techniques) have been put forth and investigated in the literature to address the Ht-dependent blood spreading on paper substrates, including the correction of quantified concentrations with a suitable correction factor (namely, an equation incorporating corrections for bias via correlation of Ht with a physical parameter), a methodology which consists of the basis for the current work.The aim of the current research undertaken within this Thesis is to introduce novel approaches on the acceptance criteria of DBS-based bioassays with the use of computational methods, in order to provide valid solutions for coping with the Ht effect in DBS analysis. As a first step in this research work, and to quantitatively assess Ht impact on the DBS measurements, a computational approach was developed and implemented in R® language. First, the % relative error was modeled with respect to Ht. Then, Monte Carlo simulations were performed in virtual adult men/women populations with different Ht levels and the % relative error in relation to the Ht used for calibrators was quantified. An upper level for % relative error being a ‘tolerable contribution’ of Ht effect to % total analytical error was finally suggested, defining, for the first time, a potential Ht range for analysis of adults’ samples, where correction of concentrations of unknown samples may be omitted. Such tolerable level for % relative error may be defined in each laboratory, also based on experimental parameters (type of paper and blood volume). As a second step of our research, a computational approach based on neonatal demographics was developed and implemented in R® language to propose a strategy using correction factors to address the Ht effect in neonatal DBS partial-spot assays. A rational “tolerance level” was also proposed for the Ht effect contribution to the total analytical error and a safe Ht range for neonatal samples, where the correction of concentrations can be omitted. Furthermore, an “alert zone” for a false positive or negative result in NBS was proposed, where the Ht effect has to be considered. As the final part of work performed for this Thesis, the correction factor approach already developed was again applied, following the utilization of an image processing algorithm developed in MATLAB® to derive a reliable equation correlating DBS areas to Ht values. The present work looks more closely at the application of image analysis to the evaluation of Ht in DBS samples. Utilizing image analysis software, DBS samples with known Ht values were processed. Preparation of cards has followed a previously developed protocol for the appropriate formation of uniform area DBSs, irrespective of Ht. The resulting areas showed close resemblance to the respective theoretical areas calculated by applying the correlation equation. Following that, the equation was utilized to determine the Ht values for each sample and a comprehensive comparison of measured versus calculated Ht was carried out, using various statistical approaches for method comparison. The results demonstrated a strong correlation, suggesting the method’s viability in estimating Ht for unknown DBS samples.Overall, this work has achieved to introduce new approaches on the acceptance criteria of DBS-based bioassays in both adult and neonate populations, using computational methodologies to investigate and address the Ht effect. It may be safely concluded that, using Ht calibration values closely representative of populations under analysis is fully rationalized, as, in this way, an acceptable level of percentage relative error can be attributed to the Ht effect leading to reduced probability for concentration corrections. Regulatory criteria for bioanalysis can, thus, be targeted, moving towards wider utilization of DBS in human pharmacokinetic and clinical trials. Also, the proposed Ht prediction methodology based on image analysis and application of a correction factor can be a valuable tool for the use of DBS analysis in real-life settings, as Ht values calculated via this approach has been proven to strongly correlate with respective measured Ht values.

Οι ξηραμένες κηλίδες αίματος (DBS) αποτελούν μια τεχνική μικροδειγματοληψίας, κατά την οποία μια πολύ μικρή ποσότητα τριχοειδούς ή φλεβικού αίματος συλλέγεται σε ειδικό, απορροφητικό διηθητικό χαρτί με τη μορφή καρτών συλλογής, οι οποίες στη συνέχεια ξηραίνονται σε συνθήκες δωματίου. Συνήθως, το αίμα που συλλέγεται προέρχεται από παρακέντηση δακτύλου ή πτέρνας (τριχοειδές αίμα), ωστόσο, μπορεί να χρησιμοποιηθεί φλεβικό αίμα μετά από τυπική αιμοληψία. Η ανάλυση πραγματοποιείται σε μικρούς δίσκους σταθερής διαμέτρου (δίσκος διάτρησης), που λαμβάνονται από το DBS μέσω αυτόματης διατρητικής μηχανής. Αν και αυτή η τεχνική έχει μακρά ιστορία στη βιοανάλυση, που χρονολογείται από αιώνες, η πρώτη εφαρμογή των ξηραμένων κηλίδων αίματος για ιατρικούς διαγνωστικούς σκοπούς έλαβε χώρα στις αρχές της δεκαετίας του 1960, όταν ο Dr. Robert Guthrie εισήγαγε ένα απλό τεστ για τη μέτρηση της φαινυλαλανίνης για την ανίχνευση της μεταβολικής διαταραχής φαινυλκετονουρίας (PKU). Από τότε, η χρήση του DBS έχει εφαρμοστεί ευρέως στη βιοανάλυση, ειδικά με ανιχνευτές φασματομετρίας μάζας, ως αξιόπιστη εναλλακτική λύση στα παραδοσιακά υγρά δείγματα. Αυτή η μέθοδος δειγματοληψίας παρουσιάζει πολλά πλεονεκτήματα. Πρώτον, η τεχνική είναι ελάχιστα επεμβατική όταν χρησιμοποιείται τριχοειδές αίμα και αυτό το γεγονός επιτρέπει τη συλλογή DBS χωρίς τη συμμετοχή υγειονομικού προσωπικού. Η συλλογή και αποθήκευση δειγμάτων είναι εύκολη και χαμηλού κόστους και η μεταφορά δειγμάτων είναι εφικτή χωρίς την εφαρμογή συγκεκριμένων συνθηκών. Για αυτούς τους λόγους, οι ξηραμένες κηλίδες αίματος χρησιμοποιούνται σήμερα ευρέως σε διάφορους κλάδους στις βιοεπιστήμες και τη φαρμακευτική έρευνα, συμπεριλαμβανομένων προκλινικών και κλινικών/φαρμακοκινητικών μελετών, παρακολούθησης των θεραπευτικών επιπέδων φαρμάκων (TDM), επιδημιολογικής επιτήρησης και μεταβολομικών μελετών. Το πιο σημαντικό είναι ότι, αυτή η τεχνική δειγματοληψίας έχει θέσει τις βάσεις για την έναρξη και την επέκταση των προγραμμάτων προσυμπτωματικού ελέγχου νεογνών παγκοσμίως, που περιλαμβάνει ένα ευρύ φάσμα βιοχημικών και γενετικών αναλύσεων σε αυτόν τον ευάλωτο πληθυσμό. Πράγματι, ο προληπτικός έλεγχος νεογνών (NBS) είναι μια πρωτοβουλία για τη δημόσια υγεία που πραγματοποιείται λίγο μετά τη γέννηση για τον εντοπισμό συγκεκριμένων γενετικών, μεταβολικών και ορμονικών διαταραχών, τις λεγόμενες ενδογενείς διαταραχές του μεταβολισμού (IEM). Υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός διαφορετικών γενετικών μεταβολικών διαταραχών (όπως διαταραχές μεταβολισμού αμινοξέων, οργανικών οξέων, λιπαρών οξέων, διαταραχές του κύκλου της ουρίας, ενδοκρινικές διαταραχές και αιμοσφαιρινοπάθειες), που ποικίλλουν ως προς τα συμπτώματα, τις θεραπευτικές προσεγγίσεις και την πορεία της νόσου. Κατά συνέπεια, ο πρωταρχικός στόχος των προγραμμάτων NBS παγκοσμίως είναι η έγκαιρη ανίχνευση ασθενειών, επιτρέποντας έγκαιρες ιατρικές και φαρμακευτικές παρεμβάσεις για τη μείωση της νοσηρότητας και της θνησιμότητας κατά τη νεογνική και παιδική ηλικία. Ως αποτέλεσμα, η ανάπτυξη και η επέκταση του NBS θεωρούνται βασικές προτεραιότητες για τη δημόσια υγεία σε πολλές χώρες. Η εισαγωγή ολοκληρωμένων προγραμμάτων NBS σε όλο τον πληθυσμό χρησιμοποιώντας τη δίδυμη φασματομετρία μάζας (MS/MS) οδήγησε σε ευρύτερα πάνελ προσυμπτωματικού ελέγχου, σημαντική αύξηση των ανιχνεύσιμων διαταραχών και ανακάλυψη προηγουμένως μη αναγνωρισμένων ασθενειών. Παρά τα πολλά πλεονεκτήματα που συνδέονται με αυτήν την εναλλακτική στρατηγική δειγματοληψίας, εξακολουθούν να υπάρχουν αρκετές προκλήσεις. Πράγματι, οι ανησυχίες σχετικά με τις ξηραμένες κηλίδες αίματος σχετίζονται συχνά με την ομοιογένεια του δείγματος, την επίδραση της θέσης διάτρησης, τα είδη του διηθητικού χαρτιού και τα χρωματογραφικά αποτελέσματα. Η συσχέτιση των συγκεντρώσεων στο φλεβικό και τριχοειδές αίμα μιας δεδομένης υπό ανάλυση ουσίας είναι φυσικά επίσης σημαντική. Ωστόσο, το πιο μελετημένο ζήτημα είναι, αναμφίβολα, το λεγόμενο «φαινόμενο του αιματοκρίτη». Ως αιματοκρίτης (Ht) ορίζεται η αναλογία του όγκου των ερυθρών αιμοσφαιρίων προς τον συνολικό όγκο αίματος. Δεν έχουν οριστεί απόλυτες τιμές αναφοράς για τον αιματοκρίτη, καθώς αυτές εξαρτώνται από διάφορες παραμέτρους, συμπεριλαμβανομένης της ηλικίας (τα νεογνά έχουν υψηλότερες και πιο μεταβλητές τιμές), του φύλου, της φυλής, των διατροφικών συνήθειών, αλλά και παθήσεων (αναιμία, πολυκυτταραιμία, ογκολογικοί και ανοσοκατεσταλμένοι ασθενείς) και άλλων καταστάσεων, όπως η εγκυμοσύνη, το κάπνισμα ή σε πληθυσμούς που κατοικούν σε υψόμετρο. Οι μετρούμενες τιμές Ht μπορεί επομένως να διαφέρουν σημαντικά μεταξύ των ατόμων και των διαφορετικών καταστάσεων υγείας. Διαφορετικές τιμές Ht οδηγούν, λόγω διαφορετικού ιξώδους, σε διαφορετικό μέγεθος κηλίδας, επηρεάζοντας το αναλυτικό σφάλμα. Το ιξώδες του αίματος είναι γνωστό ότι επηρεάζεται από τον αιματοκρίτη, το οποίο με τη σειρά του επηρεάζει το πόσο εύκολα μπορεί να διαχυθεί το αίμα στο διηθητικό χαρτί της δειγματοληψίας. Καθώς υπάρχει αύξηση των κυττάρων του αίματος σε υψηλά επίπεδα Ht, το αίμα γίνεται πιο παχύρρευστο. Τα χαρακτηριστικά ροής αίματος και έκτασης μετατόπισης του αίματος στο χαρτί επηρεάζονται λόγω των διακυμάνσεων του ιξώδους, που μπορεί επομένως να έχουν αντίκτυπο στο μέγεθος των κηλίδων αίματος που σχηματίζονται. Μια αντίστροφη γραμμική σχέση μεταξύ του εμβαδού DBS και της τιμής του Ht έχει αποδειχθεί.Λαμβάνοντας υπόψη όλα τα ανωτέρω, η επίδραση του αιματοκρίτη είναι μια ευρέως αποδεκτή πρόκληση στην ανάλυση DBS. Η πιθανή επίδραση του Ht στα χαρακτηριστικά της ανάλυσης DBS έχει μελετηθεί και, με βάση τα παραπάνω, αναγνωρίζεται ότι, εάν οι τιμές Ht των άγνωστων δειγμάτων αίματος διαφέρουν σημαντικά από την τιμή Ht των προτύπων βαθμονόμησης, αυτό σίγουρα επηρεάζει το αναλυτικό σφάλμα, οδηγώντας σε θετικό σφάλμα για υψηλότερες τιμές Ht και αρνητικό για χαμηλότερες τιμές Ht, όταν χρησιμοποιείται ένας δίσκος σταθερής διαμέτρου από το DBS. Κατά συνέπεια, η αυξημένη μεταβλητότητα στην απόδοση της ανάλυσης, μερικές φορές, μπορεί να υπερβαίνει τα τρέχοντα ισχύοντα κριτήρια αποδοχής για το συνολικό ποσοστό αναλυτικού σφάλματος. Γενικά, αυτά τα κριτήρια αποδοχής για την ακρίβεια των χρωματογραφικών μεθόδων (% σχετικό σφάλμα) ορίζονται στο ±15% και στο ±20% για το κατώτερο όριο ποσοτικοποίησης (LLΟQ). Πολλοί παράγοντες επηρεάζουν τον τρόπο με τον οποίο ο αιματοκρίτης επηρεάζει την ποσοτικοποίηση της αναλυόμενης ουσίας στα δείγματα DBS. Διάφορες στρατηγικές (βάσει διαφορετικών οργάνων και τεχνικών) έχουν διερευνηθεί στη βιβλιογραφία για την αντιμετώπιση της εξαρτώμενης από Ht έκτασης μετατόπισης του αίματος στο διηθητικό χάρτη, συμπεριλαμβανομένης της διόρθωσης ποσοτικοποιημένων συγκεντρώσεων με κατάλληλο συντελεστή διόρθωσης (δηλαδή, μια εξίσωση που επιτρέπει τη διόρθωση των τιμών συγκέντρωσης χρησιμοποιώντας την αποδεδειγμένη συσχέτιση του αιματοκρίτη με μια φυσική παράμετρο, όπως το εμβαδό της ξηραμένης κηλίδας). Στόχος της τρέχουσας έρευνας που πραγματοποιείται στο πλαίσιο αυτής της διατριβής είναι να εισαγάγει νέες προσεγγίσεις σχετικά με τα κριτήρια αποδοχής των βιοαναλύσεων που βασίζονται σε DBS με τη χρήση υπολογιστικών μεθόδων, προκειμένου να δοθούν έγκυρες λύσεις για την αντιμετώπιση του «φαινομένου του αιματοκρίτη» στην ανάλυση DBS. Ως πρώτο βήμα σε αυτήν την ερευνητική εργασία, και προκειμένου να εκτιμηθεί ποσοτικά ο αντίκτυπος του αιματοκρίτη στις μετρήσεις DBS, αναπτύχθηκε και εφαρμόστηκε μια υπολογιστική προσέγγιση με ανάπτυξη κώδικα σε γλώσσα R® που μοντελοποιεί το % σχετικό σφάλμα σε σχέση με τον αιματοκρίτη, και στη συνέχεια πραγματοποιεί προσομοιώσεις Monte Carlo σε ένα πληθυσμό ενηλίκων, ανδρών και γυναικών με σκοπό την ποσοτικοποίηση του % σχετικού σφάλματος σε σχέση με τον αιματοκρίτη που χρησιμοποιήθηκε για τη βαθμονόμηση της αναλυτικής τεχνικής. Τελικά προτείνεται ένα ανώτερο επίπεδο για το % σχετικό σφάλμα ως «επίπεδο ανοχής» του «φαινομένου του αιματοκρίτη» στο % του συνολικού αναλυτικού σφάλματος, ορίζοντας, για πρώτη φορά, ένα πιθανό εύρος Ht για ανάλυση δειγμάτων ενηλίκων, όπου η διόρθωση των συγκεντρώσεων άγνωστων δειγμάτων μπορεί να παραλειφθεί. Ένα τέτοιο ανεκτό επίπεδο για το % σχετικό σφάλμα μπορεί να οριστεί σε κάθε εργαστήριο, με βάση τις σχετικές πειραματικές παραμέτρους (τύπος χαρτιού και όγκος αίματος). Ως δεύτερο βήμα της έρευνάς μας, αναπτύχθηκε και εφαρμόστηκε αντίστοιχη υπολογιστική προσέγγιση στη γλώσσα R®, βασισμένη σε νεογνικά δημογραφικά στοιχεία, για να προτείνει στρατηγική που χρησιμοποιεί συντελεστή διόρθωσης για την αντιμετώπιση της επίδρασης του αιματοκρίτη σε προσδιορισμούς DBS νεογνών. Προτάθηκε επίσης ένα ορθολογικό «επίπεδο ανοχής» για τη συμβολή του «φαινομένου του αιματοκρίτη» στο συνολικό αναλυτικό σφάλμα και ένα ασφαλές εύρος Ht για νεογνικά δείγματα, όπου η διόρθωση των συγκεντρώσεων μπορεί να παραλειφθεί. Επιπλέον, προτάθηκε μια «ζώνη συναγερμού» για ένα ψευδώς θετικό ή αρνητικό αποτέλεσμα στο NBS, όπου πρέπει να ληφθεί υπόψη το «φαινόμενο του αιματοκρίτη». Ως το τελευταίο μέρος της εργασίας που εκτελέστηκε για αυτή τη διατριβή, εφαρμόστηκε ξανά η προσέγγιση του συντελεστή διόρθωσης που έχει ήδη αναπτυχθεί, μετά τη χρήση ενός αλγόριθμου επεξεργασίας εικόνας που αναπτύχθηκε στο MATLAB® και οδήγησε στην γραμμική εξίσωση συσχετισμού του εμβαδού DBS με τις τιμές Ht. Η παρούσα εργασία εξετάζει πιο προσεκτικά την εφαρμογή της ανάλυσης εικόνας στην εκτίμηση του Ht σε δείγματα DBS. Χρησιμοποιώντας λογισμικό ανάλυσης εικόνας, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία δείγματα DBS με γνωστές τιμές Ht. Η προετοιμασία των καρτών ακολούθησε ένα πρωτόκολλο που είχε αναπτυχθεί προηγουμένως για τον κατάλληλο σχηματισμό DBS ομοιόμορφου εμβαδού, ανεξαρτήτως Ht. Τα εμβαδά που προέκυψαν έδειξαν μεγάλη ομοιότητα με τις αντίστοιχες θεωρητικές τιμές που υπολογίστηκαν με την εφαρμογή της εξίσωσης συσχέτισης. Στη συνέχεια, η εξίσωση χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των τιμών Ht για κάθε δείγμα και διεξήχθη μια ολοκληρωμένη σύγκριση του μετρούμενου έναντι του υπολογισμένου Ht, χρησιμοποιώντας διάφορες στατιστικές προσεγγίσεις για σύγκριση μεθόδων. Τα αποτελέσματα έδειξαν μια ισχυρή συσχέτιση, υποδηλώνοντας την αξιοπιστία της μεθόδου στην εκτίμηση του Ht για άγνωστα δείγματα DBS. Συνολικά, αυτή η εργασία πέτυχε να εισαγάγει νέες προσεγγίσεις σχετικά με τα κριτήρια αποδοχής βιοαναλύσεων που βασίζονται στο DBS τόσο σε ενήλικες όσο και σε νεογνικούς πληθυσμούς, χρησιμοποιώντας υπολογιστικές μεθόδους για τη διερεύνηση και την αντιμετώπιση του «φαινομένου του αιματοκρίτη». Μπορεί να συναχθεί με ασφάλεια το συμπέρασμα ότι η χρήση τιμών βαθμονόμησης Ht που αντιπροσωπεύουν τους υπό ανάλυση πληθυσμούς είναι πλήρως εξορθολογισμένη, καθώς, με αυτόν τον τρόπο, ένα αποδεκτό επίπεδο % σχετικού σφάλματος μπορεί να αποδοθεί στο «φαινόμενο του αιματοκρίτη» που οδηγεί σε μειωμένη πιθανότητα για ανάγκη διόρθωσης των συγκεντρώσεων. Ως εκ τούτου, τα ρυθμιστικά κριτήρια για την αποδοχή του βιοαναλυτικού σφάλματος μπορούν να επιτευχθούν επιτρέποντας την ευρύτερη χρήση του DBS σε φαρμακοκινητικές και κλινικές δοκιμές. Επίσης, η προτεινόμενη μεθοδολογία πρόβλεψης Ht που βασίζεται στην ανάλυση εικόνας και την εφαρμογή ενός συντελεστή διόρθωσης μπορεί να είναι ένα πολύτιμο εργαλείο για την ευρύτερη χρήση της ανάλυσης DBS, καθώς οι τιμές Ht που υπολογίζονται μέσω αυτής της προσέγγισης έχει αποδειχθεί ότι συσχετίζονται ισχυρά με τις αντίστοιχες μετρούμενες τιμές Ht.