Οι παράμετροι που επηρεάζουν την τροποποιημένη αποδέσμευση από υβριδικά σωματίδια

Abstract

Nanotechnology has emerged as an asset in pharmaceutical science by enhancing effective pharmacotherapy via targeted drug delivery of pharmacologically active compounds with challenging physicochemical properties. Despite its promise, pharmaceutical nanotechnology applications still face hurdles, particularly due to toxicity-related concerns. Within this framework, hybrid nanoparticles composed of lipids and copolymers have garnered increasing interest as drug delivery carriers, combining the biocompatibility of lipids with the structural stability of copolymers. Notably, copolymers’ tailor-made properties offer a significant advantage in customizable therapeutic strategies according to intended needs. To date, the clinical application of such hybrid systems remains limited though due to various challenges including their complexity. Although lipid/copolymer hybrid particles have been extensively studied, especially those based on block copolymer architectures, a distinct gap persists in the literature concerning hybrid systems comprised of lipids and copolymers with alternative architectures, such as statistical or hyperbranched copolymers. This doctoral dissertation aims to explore the rational design of hybrid nanoparticles composed of marketed available and extensively used phospholipids and novel amphiphilic linear copolymers with random sequence of monomer (statistical or random copolymers). The main objective is to investigate the design parameters that influence lipid/copolymer hybrid particles performance and their modified release capability. A variety of hybrid systems were systematically studied using a broad spectrum of complementary techniques to elucidate the molecular interactions between the biomaterials and their self-assembly into nanoparticles with unique features and properties. Specifically, zwitterionic DSPC (1,2-dioctadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) and DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) phospholipids were combined with copolymers comprising a hydrophilic segment; namely POEGMA [poly(Oligo (ethylene glycol) methyl ether methacrylate)], and hydrophobic segments such as PLMA [poly(lauryl methacrylate)] or pH and temperature-responsive PDIPAEMA [poly(2-(diisopropylamino) ethyl methacrylate)]. The investigation focused on the effects of the hydrophilic side chain length and comonomer ratio on hybrid nanoparticles characteristics. The lipid to copolymer weight ratio and the lipid composition were also investigated as main design parameters. Preformulation studies were conducted via differential scanning calorimetry (DSC) on lipidic and hybrid bilayers. Afterwards, hybrid structures were prepared using the thin film hydration method, followed by size reduction via probe sonication. The hybrid nature of the particles was confirmed, and their physicochemical attributes were characterized through regulatory-standard techniques such as Dynamic Light Scattering (DLS), and advanced methodologies including Static Light Scattering (SLS), microDifferential Scanning Calorimetry (microDSC), High-Resolution Ultrasound Spectroscopy (HR-US), and cryogenic Transmission Electron Microscopy (cryo-TEM). Fluorescence spectroscopy utilizing hydrophobic probes (e.g., pyrene, Laurdan) provided insight into membrane polarity and fluidity. Biocompatibility was evaluated primarily via the well-established in vitro MTS assay, confirming the safety profile of the majority of investigated hybrid systems. Selected formulations were tested for their capability for drug encapsulation using methotrexate as a model hydrophobic therapeutic agent. The innovation of this work lies in both the selection of biomaterials and the application of advanced characterization techniques, marking the first-time preparation and comprehensive evaluation of DSPC:DOPC:P(OEGMA-co-LMA) and DSPC:DOPC:P(OEGMA-co-DIPAEMA) hybrid particles. Remarkably, the DSPC:P(OEGMA-co-DIPAEMA) systems demonstrated statistically significant in vitro anticancer activity and selectivity in cancer cell lines, suggesting that these systems may inhibit the intrinsic toxicity of methotrexate. Furthermore, they exhibited modified release capability due to the in vitro pH sensitive drug release profile as well as sustained release under acidic conditions for up to 24 hours. The random architecture of the copolymers was found to be a critical parameter influencing both the behavior of empty and drug-loaded nanoparticles. Ultimately, the overall performance of these lipid/statistical copolymer hybrid nanoparticles is governed by themolecular interactions of the constituent biomaterials and their co-assembly, modulated by key design parameters such as copolymer architecture, lipid to polymer ratio, lipid composition, and the hydrophilic to hydrophobic balance. In conclusion, the unmet need for innovative drug delivery systems capable of sustained release, along with the imperative need for an in-depth understanding of their properties, has driven the present dissertation toward the development of hybrid lipid/random copolymer carriers. This work highlights the key design parameters and underscores the importance of investigating these systems via multiple complimentary characterization methods, with the ultimate goal of their rapid and effective clinical translation. Consequently, the hybrid lipid/ random copolymer systems, explored extensively in this doctoral thesis, may serve as promising prototypical systems for the study of interactions among materials of diverse chemical nature and origin, with promising implications for applications in both Pharmaceutical Technology and Biomimetics.

Η νανοτεχνολογία ως εργαλείο της φαρμακευτικής επιστήμης έχει ευνοήσει τη φαρμακευτική τεχνολογία μέσω δυνατοτήτων για στοχευμένη φαρμακοθεραπεία και χορήγηση φαρμακολογικά δραστικών ουσιών με δύσκολα στη διαχείριση χαρακτηριστικά. Ωστόσο, εμφανίζει και προκλήσεις στην εφαρμογή κυρίως λόγω προβλημάτων τοξικότητας. Στο πλαίσιο αυτό, τα υβριδικά σωματίδια αποτελούμενα από λιπίδια και συμπολυμερή αποτελούν φορείς φαρμακολογικά δραστικών ουσιών με ενδιαφέροντα και ελπιδοφόρα χαρακτηριστικά λόγω της βιοσυμβατότητας των λιπιδίων και της σταθερότητας των συμπολυμερών, και κυρίως των εξατομικευμένων χαρακτηριστικών τους ανάλογα με τις εκάστοτε ανάγκες. Η κλινική τους εφαρμογή μέχρι σήμερα είναι περιορισμένη λόγω διάφορων προκλήσεων, που αντιμετωπίζουν, συμπεριλαμβανομένης της πολυπλοκότητάς τους. Αν και τα υβριδικά σωματίδια αυτής της σύστασης έχουν μελετηθεί αρκετά, εντούτοις υπάρχει εμφανές κενό στη βιβλιογραφία όσον αφορά υβριδικά σωματίδια λιπιδίου/συμπολυμερούς με αρχιτεκτονική διαφορετική από αυτή των γραμμικών συμπολυμερών κατά συστάδες (block copolymers). Ως εκ τούτου, η διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων και των ιδιοτήτων υβριδικών συστημάτων, που αποτελούνται από λιπίδια και συμπολυμερή πιο πολύπλοκης αρχιτεκτονικής – όπως στατιστικά ή υπερδιακλαδισμένα – μπορεί να προσφέρει πολύτιμες πληροφορίες για την επιστήμη των υλικών, τη βιομιμητική και τη φαρμακευτική τεχνολογία. Σε αυτό το πλαίσιο, η παρούσα διδακτορική διατριβή έχει ως κύριο αντικείμενο τη μελέτη και τον ορθολογικό σχεδιασμό υβριδικών σωματιδίων αποτελούμενα από συμβατικά φωσφολιπίδια με ευρεία κλινική εφαρμογή και από καινοτόμα αμφίφιλα και γραμμικά συμπολυμερή με τυχαία διευθέτηση των μονομερών τους (στατιστικά ή τυχαία συμπολυμερή) με στόχο τη μελέτη των παραμέτρων σχεδιασμού που επηρεάζουν την τροποποιημένη αποδέσμευση. Για το σκοπό αυτό, διαφορετικά υβριδικά συστήματα εξετάστηκαν με πληθώρα συμπληρωματικών τεχνικών για τη διασαφήνιση των πολύπλοκων αλληλεπιδράσεων μεταξύ των βιοϋλικών και την αυτοσυναρμολόγησή τους σε υβριδικά σωματίδια με μοναδικά χαρακτηριστικά και ιδιότητες. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν τα ιοντικής φύσεως φωσφολιπίδια DSPC (1,2-διοκταδεκανοϋλ-sn-γλυκερο-3-φωσφατιδυλχολίνη), και DOPC (1,2-διολεοϋλ-sn-γλυκερο-3-φωσφατιδυλχολίνη), ενώ επιλέχθηκαν συμπολυμερή αποτελούμενα από ένα υδρόφιλο πολυμερές το POEGMA [πολυ(μεθακρυλικός εστέρας της ολιγο αιθυλενογλυκόλης)] και ένα υδρόφοβο πολυμερές το PLMA [πολυ(μεθακρυλικός εστέρας της δωδεκανόλης)], για τη διερεύνηση της επίδρασης του μήκους της υδρόφιλης πλευρικής αλυσίδας OEGMA, καθώς και της διαφορετικής αναλογίας των μονομερών στα χαρακτηριστικά των υβριδικών σωματιδίων. Σε άλλες περιπτώσεις επιλέχθηκε ως υδρόφοβο τμήμα το μονομερές μεθακρυλικός 2-(διισοπροπυλαμινο) αιθυλεστέρας) που σχηματίζει ένα πολυμερές με ιδιότητες απόκρισης σε αλλαγές του pH και της θερμοκρασίας το ΡDIPAEMA [πολυ(μεθακρυλικός 2-(διισοπροπυλαμινο) αιθυλεστέρας)] για τη μελέτη της διατήρησης των ιδιοτήτων αυτών στα υβριδικά σωματίδια, καθώς και της επίδρασης στη συνολική συμπεριφορά των συστημάτων. Τα υβριδικά σωματίδια μελετήθηκαν σε διαφορετικές αναλογίες λιπιδίου/συμπολυμερούς και διαφορετική λιπιδική και πολυμερική σύσταση και εξήχθησαν συμπεράσματα για το πως οι διαφορετικοί παράμετροι σχεδιασμού επηρεάζουν τη θερμοτροπική και φυσικοχημική συμπεριφορά των υβριδικών σωματιδίων, τη μορφολογία, τη ρευστότητα της μεμβράνης, και την τοξικότητά τους. Αρχικά, έγιναν μελέτες προμορφοποίησης με Διαφορική Θερμιδομετρία Σάρωσης σε λιπιδικές και υβριδικές διπλοστοιβάδες, ενώ στη συνέχεια παρασκευάστηκαν υβριδικά σωματίδια με τη μέθοδο ενυδάτωσης λεπτού υμενίου (Thin Film Hydration Method), ενώ το μέγεθός τους μειώθηκε με την τεχνική της υπερήχησης με ακίδα (Probe Sonication). Η υβριδική φύση των σωματιδίων αποδείχθηκε και οι ιδιότητες αυτών μελετήθηκαν με τεχνικές, που ήδη ζητούνται από τις ρυθμιστικές αρχές, όπως η Δυναμική Σκέδαση Φωτός (DLS), αλλά και ιδιαίτερα καινοτόμες όπως η Στατική Σκέδαση Φωτός (SLS), η Μικροδιαφορική Θερμιδομετρία Σάρωσης (microDSC), η Φασματοσκοπία Υπερήχων Υψηλής Ευκρίνειας (HR-US), και η κρυογονική Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Διέλευσης (cryo-TEM). Χρησιμοποιήθηκε, ακόμα, η Φασματοσκοπία Φθορισμού με υδρόφοβους ανιχνευτές, όπως το πυρένιο και το Laurdan, για τη μελέτη του εσωτερικού περιβάλλοντος των σωματιδίων από πλευράς πολικότητας και ρευστότητας. Η βιοσυμβατότητα των υβριδικών σωματιδίων εξετάστηκε και στις περισσότερες περιπτώσεις επιβεβαιώθηκε με την παγιωμένη in vitro δοκιμασία MTS. Στη συνέχεια, επιλεγμένα συστήματα εξετάστηκαν για την ικανότητά τους να ενσωματώνουν υδρόφοβα μόρια, χρησιμοποιώντας ως μοντέλο τη φαρμακολογικά δραστική ουσία μεθοτρεξάτη. Η καινοτομία της παρούσας εργασίας έγκειται τόσο στα βιοϋλικά που χρησιμοποιήθηκαν, καθώς παρασκευάστηκαν και μελετήθηκαν με πληθώρα καινοτόμων τεχνικών υβριδικά σωματίδια σύστασης DSPC:DOPC:P(OEGMA-co-LMA) και DSPC:DOPC:P(OEGMA-co-DIPAEMA) για πρώτη φορά, καθώς και στη μελέτη και την επιτυχή ενσωμάτωση της αντικαρκινικής ουσίας μεθοτρεξάτης. Μάλιστα, τα υβριδικά σωματίδια σύστασης DSPC:P(OEGMA-co-DIPAEMA) κατάφεραν να εμφανίσουν στατιστικά σημαντική in vitro αποτελεσματικότητα και εκλεκτικότητα σε καρκινικές σειρές με δοκιμασία MTT υποδεικνύοντας την «απόκρυψη» της εγγενούς τοξικότητας της μεθοτρεξάτης, ενώ εμφάνισαν και χαρακτηριστικά τροποποιημένης αποδέσμευσης σύμφωνα με το in vitro pH αποκρινόμενο προφίλ αποδέσμευσής τους εμφανίζοντας παρατεταμένη αποδέσμευση σε όξινο περιβάλλον για τουλάχιστον 24 ώρες. Υψίστης σημασίας είναι η τυχαία αρχιτεκτονική των συμπολυμερών αυτών, η οποία αποδείχθηκε σημαντική παράμετρος, που επιδρά στη συμπεριφορά «κενών και έμφορτων» υβριδικών σωματιδίων σύστασης λιπιδίου/συμπολυμερούς. Συμπερασματικά, η ανάγκη για καινοτόμα συστήματα χορήγησης φαρμακολογικά δραστικών ουσιών με ικανότητα παρατεταμένης αποδέσμευσης και για την σε βάθος κατανόηση των χαρακτηριστικών τους καθοδήγησε την προσπάθεια αυτή για την ανάπτυξη υβριδικών φορέων μεταβαλλόμενης σύστασης λιπιδίου/συμπολυμερούς αναδεικνύοντας τους σημαντικότερους παράγοντες σχεδιασμού και τονίζοντας τη σημασία της πολυδιάστατης μελέτης των χαρακτηριστικών τους, με στόχο την ταχεία και επιτυχή κλινική τους αξιοποίηση. Η συμπεριφορά των υβριδικών σωματιδίων σύστασης λιπιδίου/στατιστικού συμπολυμερούς φαίνεται να ορίζεται με βάση τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των διαφορετικής φύσεως βιοϋλικών και την αυτοσυναρμολόγησή τους με βάση παραμέτρους, όπως η τυχαία αρχιτεκτονική του συμπολυμερούς, η αναλογία λιπιδίου/συμπολυμερούς, η σύσταση σε λιπίδια και πολυμερή, καθώς και η ισορροπία μεταξύ υδρόφοβων και υδρόφιλων τμημάτων. Επομένως, τα συστήματα που μελετήθηκαν εκτενώς στην παρούσα διδακτορική διατριβή θα μπορούσαν να λειτουργήσουν ως πρότυπα για τη μελέτη της αλληλεπίδρασης υλικών διαφορετικής χημικής φύσης και προέλευσης, με πολλές πιθανές εφαρμογές τόσο στο πεδίο της Φαρμακευτικής Τεχνολογίας όσο και στο πεδίο της Βιολογίας/Βιομιμητικής.