Investigation of the role of p110δ PI3K and RhoA in cancer and metastasis in in vivo mouse models

Abstract

Phosphoinositide-3 kinase delta (PI3Kδ) is an isoform of class I PI3Ks, composed of the catalytic p110δ subunit and one of five regulatory p85 subunits. While primarily studied in immune cells, PI3Kδ has also been implicated in cancer progression. On the other hand, PTEN is a tumor suppressor that negatively regulates PI3K-Akt signaling, preventing uncontrolled cell proliferation and survival. The loss or inactivation of PTEN is frequently observed in cancer, leading to hyperactivation of the PI3K pathway and promoting tumorigenesis. This PhD thesis aims on one hand to elucidate the mechanisms linking PI3Kδ with PTEN in cancers expressing high p110δ levels, such as breast cancer and on the other, to investigate whether PI3Kδ inhibition, either as monotherapy or in combination with other treatments, holds therapeutic potential in cancers expressing low p110δ levels, such as skin cancer. To address these research objectives, the current PhD thesis has been divided into three main parts. In the first part, we investigated the mechanisms by which PTEN is activated following PI3Kδ inhibition, with a specific focus on identifying the tyrosine kinase responsible for PTEN tyrosine phosphorylation downstream of the RhoA/ROCK pathway. We demonstrated that focal adhesion kinase (FAK) phosphorylates PTEN, and we identified Tyr336 on PTEN as the phosphorylation site targeted by FAK. This phosphorylation event enhanced PTEN’s phosphatase activity, protein–lipid interactions, and overall protein stability. Furthermore, in high p110δ-expressing cells, such as macrophages and breast cancer cell lines, we found that FAK phosphorylation/activity is negatively regulated by PI3Kδ, while is positively regulated by RhoA-associated kinase (ROCK). Indeed, FAK phosphorylation was increased in these cells upon p110δ inhibition, whereas pharmacologic inhibition of RhoA/ROCK restored FAK phosphorylation levels back to normal levels. Similarly, inhibition of FAK reduced PTEN phosphorylation and restored the functional defects associated with p110δ inactivation, including the increased Akt phosphorylation and cell proliferation. Conclusively, this work identifies FAK as a target of PI3Kδ that links RhoA with PTEN and establishes for the first time that PTEN is a substrate of FAK-mediated Tyrosine phosphorylation.In the second part, we investigated the association between PI3Kδ and PTEN in breast cancer progression. Although no mutations in the p110δ subunit have been detected in breast cancer, we found that p110δ expression gradually increases, while PTEN activity progressively declines during breast tumor progression in mice. Moreover, pharmacological inactivation of p110δ in mice effectively halted breast tumor growth, with this effect to be mechanistically linked to the restoration and enhancement of PTEN activity in tumor cells. These findings highlight the potential of p110δ inhibition as a therapeutic strategy for breast cancer by restoring PTEN function. In the third part, we explored whether a combination treatment consisting of the selective inhibition of PI3Kδ in macrophages alongside with local inhibition of p190RhoGAP in cancer cells could impact growth and metastasis of tumors lacking or expressing low p110δ, such as skin cancers, including malignant melanoma and cutaneous squamous cell carcinoma (cSCC), which typically exhibit low p110δ expression, making them ideal models for studying alternative therapeutic strategies beyond single PI3Kδ inhibition. Moreover, given that macrophages play a key role in the tumor microenvironment (TME) and often promote cancer progression, while p110δ is highly expressed in immune cells, including macrophages, its inhibition has the potential to impair macrophage functions. Meanwhile, p190RhoGAP suppresses RhoA/ROCK pathway, influencing tumor cell migration and metastasis. Importantly, by downregulating RhoA/ROCK, p190RhoGAP may also promote tumor progression by suppressing PTEN’s tumor-suppressor activity. Indeed, our findings demonstrate that melanoma and cSCC progression can be effectively blocked by the combined inhibition of PI3Kδ in macrophages and p190RhoGAP in tumor cells. Specifically, we found that targeted deletion of p190RhoGAP in tumor cells, combined with the adoptive transfer of macrophages from δD910A/D910A mice into tumor-bearing mice, significantly abrogated melanoma and SCC progression, by simultaneously activating RhoA and PTEN in tumor cells and reducing the accumulation of tumor-associated macrophages (TAMs) within the tumors. Notably, the effectiveness of this combined treatment was consistent across melanoma tumors lacking activating BRAF mutations and those harboring the common BRAF(V600E) mutation. Additionally, the efficiency if this therapy was associated with decreased autotaxin (ATX) expression in tumor cells and the surrounding stroma, effectively bypassing the positive feedback loop of ATX expression observed with direct pharmacological ATX inhibition. Together, these findings underscore the importance of targeting both cancer cells and macrophages in skin cancer therapy and reveal a previously unrecognized reverse link between ATX and RhoA, highlighting further the therapeutic potential of p110δ inhibition as part of a combinatorial regimen for treating skin cancers.

Η 3’ κινάση του φωσφοϊνοσιτιδίου δέλτα (PI3Kδ) είναι μια ισομορφή των κλάσης Ι PI3Ks, που αποτελείται από την καταλυτική υπομονάδα p110δ και μία από τις πέντε ρυθμιστικές υπομονάδες p85. Αν και έχει μελετηθεί κυρίως για τις δράσεις της στα ανοσολογικά κύτταρα, η PI3Kδ έχει επίσης συσχετιστεί με την εξέλιξη του καρκίνου. Από την άλλη, η PTEN είναι ένας ογκοκατασταλτικός παράγοντας που ρυθμίζει αρνητικά το σηματοδοτικό μονοπάτι της PI3K, αποτρέποντας τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των κυττάρων. Η απώλεια ή η απενεργοποίηση της PTEN παρατηρείται συχνά στον καρκίνο, οδηγώντας σε υπερενεργοποίηση του μονοπατιού της PI3K και προάγοντας την καρκινογένεση. Η παρούσα διδακτορική διατριβή στοχεύει αφενός στη διευκρίνιση των μηχανισμών που συνδέουν την PI3Kδ με την PTEN σε καρκίνους με υψηλή έκφραση της p110δ, όπως ο καρκίνος του μαστού και αφετέρου, διερευνά κατά πόσο η αναστολή της PI3Kδ, είτε ως μονοθεραπεία είτε σε συνδυασμό με άλλες θεραπείες, μπορεί να έχει θεραπευτικό δυναμικό σε καρκίνους με χαμηλή έκφραση της p110δ, όπως ο καρκίνος του δέρματος. Για την επίτευξη αυτών των ερευνητικών στόχων, η διδακτορική διατριβή έχει χωριστεί σε τρία κύρια μέρη. Στο πρώτο μέρος, διερευνήσαμε τους μηχανισμούς μέσω των οποίων ενεργοποιείται η PTEN μετά την αναστολή της p110δ, με ιδιαίτερη έμφαση στον εντοπισμό της κινάσης τυροσίνης που αυξάνει τη φωσφορυλίωση της PTEN σε τυροσίνη, καθοδικά του μονοπατιού RhoA/ROCK. Αποδείξαμε ότι η κινάση των προσκολλήσεων (FAK) φωσφορυλιώνει την PTEN και εντοπίσαμε το κατάλοιπο Tyr336 ως το σημείο φωσφορυλίωσης που στοχεύεται από την FAK. Αυτό το γεγονός φωσφορυλίωσης αύξησε την ενεργότητα της PTEN, τις αλληλεπιδράσεις της με λιπίδια και τη συνολική σταθερότητα της πρωτεΐνης. Επιπλέον, σε κύτταρα με υψηλή έκφραση p110δ, όπως τα μακροφάγα και κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού, βρήκαμε ότι η φωσφορυλίωση της FAK ρυθμίζεται αρνητικά από την PI3Kδ, ενώ ρυθμίζεται θετικά από την κινάση ROCK. Συγκεκριμένα, η φωσφορυλίωση της FAK ήταν αυξημένη σε αυτά τα κύτταρα υπό την απενεργοποίηση της p110δ, ενώ η φαρμακολογική αναστολή της RhoA/ROCK επανέφερε τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της FAK στα φυσιολογικά επίπεδα. Παρομοίως, η αναστολή της FAK μείωσε τη φωσφορυλίωση της PTEN και αποκατέστησε τις λειτουργικές ανωμαλίες που σχετίζονται με την απενεργοποίηση της p110δ, συμπεριλαμβανομένης της αυξημένης φωσφορυλίωσης της Akt και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Συμπερασματικά, αυτή η μελέτη αναδεικνύει την FAK ως ένα στόχο της PI3Kδ που συνδέει το RhoA με την PTEN και καθιερώνει, για πρώτη φορά, την PTEN ως υπόστρωμα της FAK.Στο δεύτερο μέρος, διερευνήσαμε τη σχέση μεταξύ PI3Kδ και PTEN στην εξέλιξη του καρκίνου του μαστού. Αν και δεν έχουν ανιχνευθεί μεταλλάξεις στην υπομονάδα p110δ στον καρκίνο του μαστού, διαπιστώσαμε ότι η έκφραση της p110δ αυξάνεται σταδιακά, ενώ η δραστικότητα της PTEN μειώνεται προοδευτικά κατά την εξέλιξη των όγκων του μαστού σε ποντίκια. Επιπλέον, η φαρμακολογική αναστολή της p110δ στα ποντίκια ανέστειλε αποτελεσματικά την ανάπτυξη των όγκων του μαστού, με αυτό το αποτέλεσμα να συσχετίζεται μηχανιστικά με την αποκατάσταση και ενίσχυση της δραστικότητας της PTEN στα καρκινικά κύτταρα. Αυτά τα ευρήματα ενισχύουν την προοπτική της αναστολής της p110δ ως θεραπευτική στρατηγική για τον καρκίνο του μαστού μέσω της αποκατάστασης της λειτουργίας της PTEN. Στο τρίτο μέρος, εξετάσαμε εάν μια συνδυαστική θεραπεία που περιλαμβάνει την εκλεκτική αναστολή της p110δ στα μακροφάγα, σε συνδυασμό με την αναστολή της p190RhoGAP στα καρκινικά κύτταρα, μπορεί να επηρεάσει την ανάπτυξη και τη μετάσταση όγκων που δεν εκφράζουν p110δ. Ειδικά, οι καρκίνοι του δέρματος, όπως το κακόηθες μελάνωμα και το ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (SCC) εμφανίζουν συνήθως χαμηλή έκφραση της p110δ, καθιστώντας τους ιδανικά μοντέλα για τη μελέτη εναλλακτικών θεραπευτικών στρατηγικών πέρα από τη μονοθεραπεία με αναστολείς της p110δ. Επιπροσθέτως, τα μακροφάγα διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στο μικροπεριβάλλον του όγκου (TME) και συχνά προάγουν την εξέλιξη του καρκίνου. Δεδομένου ότι η p110δ εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα στα ανοσοκύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των μακροφάγων, η αναστολή της μπορεί να επηρεάσει τη λειτουργία τους. Παράλληλα, η p190RhoGAP καταστέλλει την ενεργοποίηση του μονοπατιού RhoA/ROCK, επηρεάζοντας τη μετανάστευση και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων. Σημαντικά, η καταστολή της RhoA/ROCK από την p190RhoGAP μπορεί επίσης να προάγει την εξέλιξη του όγκου, μέσω της αναστολής της αντικαρκινικής δράσης της PTEN. Πράγματι, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η ανάπτυξη και η μετάσταση του μελανώματος και του SCC μπορούν να ανασταλούν αποτελεσματικά μέσω της συνδυαστικής αναστολής της PI3Kδ στα μακροφάγα και της p190RhoGAP στα καρκινικά κύτταρα. Συγκεκριμένα, διαπιστώσαμε ότι η στοχευμένη καταστολή της p190RhoGAP στα καρκινικά κύτταρα, σε συνδυασμό με τη μεταφορά μακροφάγων από ποντίκια δD910A/D910A σε ποντίκια με όγκους, ανέστειλε σημαντικά την εξέλιξη του μελανώματος και του SCC, ενεργοποιώντας ταυτόχρονα τις RhoA και PTEN στα καρκινικά κύτταρα, ενώ μείωσε τη συσσώρευση των ογκο-συσχετιζόμενων μακροφάγων (TAMs). Αξιοσημείωτο είναι ότι η αποτελεσματικότητα αυτής της συνδυαστικής θεραπείας ήταν η ίδια τόσο σε όγκους μελανώματος χωρίς ενεργοποιητικές μεταλλάξεις στο BRAF όσο και σε όγκους που έφεραν τη συχνότερη μετάλλαξη BRAF(V600E). Επιπλέον, η επιτυχία αυτής της θεραπείας συσχετίστηκε με μειωμένη έκφραση της αυτοταξίνης (ATX) στα καρκινικά κύτταρα και στο στρώμα του όγκου, παρακάμπτοντας τον θετικό μηχανισμό ανάδρασης που παρατηρείται όταν η ATX αναστέλλεται φαρμακολογικά απευθείας. Συνολικά, τα ευρήματα αυτά υπογραμμίζουν τη σημασία της ταυτόχρονης στόχευσης τόσο των καρκινικών κυττάρων όσο και των μακροφάγων στη θεραπεία του καρκίνου του δέρματος, αναδεικνύουν έναν άγνωστο μέχρι σήμερα αντίστροφο μηχανισμό σύνδεσης μεταξύ ATX και RhoA και προτείνουν την αναστολή της PI3Kδ ως μέρος μιας συνδυαστικής θεραπευτικής προσέγγισης για τη θεραπεία των καρκίνων του δέρματος.