Genomics of host-pathogen interactions & molecular evolution of viruses that cause persistent infections

Abstract

Hepatitis B Virus (HBV) remains a significant challenge to global health, as it is associated with persistent infections that may lead to chronic hepatitis B (CHB) and hepatocellular carcinoma (HCC). The integration of HBV DNA into the host genome has a crucial role in the progression of liver disease. However, the specific mechanisms, genomic hotspots, and clinical implications associated with HBV integrations are not yet fully understood. This thesis utilises advanced genomic techniques and tailor-made bioinformatics tools to explore the biology of HBV integration, the interactions between the host and the virus, and the evolutionary dynamics. A thorough meta-analysis of HBV integration sites, derived from more than 4,500 liver biopsy samples from patients with chronic hepatitis B (CHB) and HBV-related hepatocellular carcinoma (HBV-HCC), uncovered unique genomic hotspots of integration. The findings highlighted a preference for integration to occur in transcriptionally active regions and indicated connections to the severity and progression of the disease. To overcome methodological limitations, a novel third-generation long-PCR-based target enrichment protocol coupled with Nanopore sequencing and a dedicated bioinformatics pipeline were developed and optimized. This method facilitated sensitive and accurate identification of HBV integration events.The experimental validation involved a variety of hepatocyte models, such as HepG2-NTCP cells, HepDE19 cells, mouse-passaged primary human hepatocytes (mpPHHs), and pre-infected mpPHHs. The findings revealed that HBV integrations occur independently of the viral load, display genotype-specific integration patterns, and demonstrate unique temporal dynamics. Functional analyses revealed a consistent disruption of host pathways, especially those related to metabolic reprogramming, epigenetic regulation, oncogenic signalling, and immune modulation. Furthermore, a thorough examination of 6,195 ancient human whole-genome sequencing (WGS) datasets resulted in the successful reconstruction of 12 ancient HBV genomes, greatly enhancing our understanding of the evolutionary history of HBV. Phylogenetic analyses have uncovered patterns of lineage-specific dispersal from the Neolithic era to historical periods, offering important insights into the co-existence of HBV and humans. This thesis contributes to our understanding of HBV integration biology by providing novel genomic tools and analytical frameworks that will support future research. The results discussed in this study enhance our understanding of the clinical risk of persistent HBV infection, could enable more precise therapeutic strategies, and ultimately provide valuable insights into the mechanisms of persistence and subsequent malignancy transformation and evolution of HBV.

Ο ιός της Ηπατίτιδας Β (HBV) αποτελεί σημαντική πρόκληση για τη δημόσια υγεία παγκοσμίως, καθώς συνδέεται με επίμονες λοιμώξεις που μπορεί να εξελιχθούν σε Χρόνια Ηπατίτιδα Β (CHB) και Ηπατοκυτταρικό Καρκίνωμα (HCC). Η ενσωμάτωση του DNA του HBV στο γονιδίωμα του ξενιστή διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στην εξέλιξη της ηπατικής νόσου. Ωστόσο, οι ακριβείς μηχανισμοί, οι γονιδιωματικοί τόποι που αποτελούν συστηματικούς στόχους ενσωμάτωσης και οι κλινικές επιπτώσεις των HBV ενσωματώσεων δεν έχουν ακόμη αποσαφηνιστεί. Η παρούσα διατριβή αξιοποιεί προηγμένες γονιδιωματικές τεχνικές για να διερευνήσει τη βιολογία της ενσωμάτωσης του HBV, τις αλληλεπιδράσεις ξενιστή-παθογόνου και τη δυναμική της εξέλιξης. Μια εκτενής μετα-ανάλυση θέσεων ενσωμάτωσης HBV, που προέρχονται από περισσότερα από 4500 δείγματα βιοψίας ήπατος ασθενών με CHB και HBV-συσχετιζόμενο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HBV-HCC), αποκάλυψε γονιδιωματικές περιοχές του ανθρώπινου γονιδίωματος που ο ιός ενσωματώνεται συστηματικά. Τα ευρήματα ανέδειξαν προτίμηση για ενσωμάτωση σε μεταγραφικά ενεργές περιοχές και υπέδειξαν συσχετίσεις με τη σοβαρότητα και την εξέλιξη της νόσου. Για να ξεπεραστούν μεθοδολογικοί περιορισμοί, αναπτύχθηκε και βελτιστοποιήθηκε ένα νέο πρωτόκολλο εμπλουτισμού στόχου βασισμένο σε long-PCR, σε συνδυασμό με αλληλούχηση τρίτης γενεάς (Nanopore) και μια εξειδικευμένη βιοπληροφορική ροή εργασίας. Η μέθοδος αυτή επέτρεψε την ευαίσθητη και ακριβή ταυτοποίηση γεγονότων ενσωμάτωσης HBV. Η πειραματική επικύρωση περιελάμβανε ποικιλία ηπατοκυττάρικών μοντέλων, όπως κύτταρα HepG2-NTCP και HepDE19, πρωτογενή ανθρώπινα ηπατοκύτταρα που έχουν προαχθεί σε ποντίκια (mpPHHs, mouse-passaged Primary Human Hepatocytes) και προ-μολυσμένα mpPHHs. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η συχνότητα και η κατανομή των ενσωματώσεων δεν επηρεάζεται από το ιικό φορτίο, ενώ ο γονότυπος και η χρονική διάρκεια της μόλυνσης φαίνεται παίζουν καθοριστικό ρόλο. Λειτουργικός σχολιασμός των γονιδιωματικών συντεταγμένων που διαταράσσονται από HBV ενσωματώσεις αποκάλυψε τη συστηματική διαταραχή συγκεκριμένων βιολογικών μονοπατιών, ιδίως εκείνων που σχετίζονται με τον μεταβολισμό, την επιγενετική ρύθμιση, ογκο-προωθητικά μονοπάτια και την ανοσορρύθμιση. Επιπλέον, διεξοδική εξέταση 6195 συνόλων δεδομένων αλληλούχησης ολόκληρου γονιδιώματος (WGS, Whole Genome Sequencing), προερχόμενα από δείγματα ανθρώπινων αρχαιολογικών κατάλοιπων οδήγησε στην επιτυχή ανακατασκευή 12 αρχαίων γονιδιωμάτων HBV, διευρύνοντας σημαντικά την κατανόησή μας για την εξελικτική ιστορία του ιού. Φυλογενετικές αναλύσεις αποκάλυψαν μοτίβα διασποράς συγκεκριμένων στελεχών του ιού από τη Νεολιθική εποχή έως ιστορικές περιόδους, προσφέροντας πολύτιμες πληροφορίες για τη συν-ύπαρξη HBV και ανθρώπου ανά τους αιώνες. Η διατριβή αυτή συμβάλλει στην κατανόηση της βιολογίας των HBV ενσωματώσεων προσφέροντας καινοτόμες εργαστηριακές μεθόδους γονιδιωματικής και εξειδικευμένα βιοπληροφορικά εργαλεία που μπορούν να υποστηρίξουν μελλοντικές έρευνες. Τα αποτελέσματα ενισχύουν τη γνώση μας για τον κλινικό κίνδυνο της επίμονης λοίμωξης από HBV, δύνανται να επιτρέψουν πιο στοχευμένες θεραπευτικές στρατηγικές και παρέχουν πολύτιμες πληροφορίες για τους μηχανισμούς επιμονής της λοίμωξης, κακοήθους μετασχηματισμού και εξέλιξης του HBV.