Μοριακή ανάλυση του μεταγραφώματος των ριβοσωμάτων κατά την ερυθροποίηση και -ομική προσέγγιση για τη φαρμακολογική αξιοποίηση στις ριβοσωμοπάθειες

Abstract

Erythropoiesis remains a complex biological process with several unresolved aspects, particularly regarding the molecular transitions that accompany its progression. A deeper understanding of the mechanisms connected with erythroid differentiation could contribute to the development of novel therapeutic targets for related pathologies. This dissertation investigates the transcriptomic landscape of MEL cells, an established cellular model of erythropoiesis with the aim of identifying genes that may serve as potential drug targets. During differentiation induced by HMBA, activation of signaling pathways associated with cell-cycle arrest and hemoglobin synthesis was confirmed, reflecting the transition toward a mature erythrocyte phenotype. Comprehensive analysis of Ribosome-Associated Proteins (RAPs) at both the proteomic and transcriptomic levels revealed an up-regulation of RAPs implicated in heme biosynthesis and a down-regulation of RAPs involved in rRNA processing and ribosome biogenesis. STEAP3 was selected to be furtherly explored as a potential RAP. Prior to differentiation, STEAP3 was detected within monosomes (80S) and free ribosomal subunits (40S, 60S), while it was absent in polysomes. Post induction, STEAP3 was no longer present in any ribosomal fraction. Furthermore, immunoprecipitation assays demonstrated an interaction between STEAP3 and translation-associated factors (e.g., EIF3a), suggesting a new role for STEAP3 as a regulator of translational activity. Moreover, silencing of the Steap3 gene in MEL cells caused extensive remodeling of both transcriptomic and proteomic profiles, including the activation of multiple erythroid markers, the induction of several ferroptosis-promoting factors, and a decrease in several ferroptosis inhibitors. In parallel, the effect of compound 001, an antagonistic molecule targeting STEAP3, was examined. Its action recapitulated the effects of Steap3 silencing. Although the level of response varied among the markers analyzed, compound 001 consistently induced a notable increase in β-globin expression at both the transcript and protein levels. This observation suggests that compound 001 may facilitate the onset of erythroid differentiation and represents a promising lead for further investigation. Moreover, ferroptosis markers were evaluated during HMBA-induced differentiation of MEL cells. The observed up-regulation of ferroptosis inducers and down-regulation of inhibitors support the notion that ferroptosis may constitute a physiological, concomitant mechanism of erythropoiesis. This hypothesis was further tested through treatment with erastin, a well-known ferroptosis inducer, which led to a modest increase in erythroid markers; however, its pronounced cytotoxic stress appeared to outweigh any differentiating potential. Collectively, this work characterizes STEAP3 as an enzyme with a multifactional role in erythropoiesis, influencing translational control, ribosome biogenesis, and ferroptotic signaling. At the same time, compound 001 emerges as a promising pharmacological candidate. These findings provide new insights for the development of targeted therapeutic strategies in disorders of erythropoiesis.

Η ερυθροποίηση εξακολουθεί να αποτελεί μια βιολογική διεργασία με αρκετά αναπάντητα ερωτήματα, ιδίως σε ό,τι αφορά τις μοριακές μεταβολές που λαμβάνουν χώρα κατά την πρόοδό της. Η σε βάθος κατανόηση των μηχανισμών που διέπουν την ερυθροδιαφοροποίηση μπορεί να συμβάλει ουσιαστικά στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στόχων και φαρμακολογικών παρεμβάσεων για παθήσεις που σχετίζονται με αυτή. Η παρούσα διατριβή εστίασε στη μελέτη του μεταγραφώματος των κυττάρων MEL, ενός καθιερωμένου κυτταρικού μοντέλου για την ερυθροποίηση, με στόχο τον εντοπισμό πιθανών γονιδίων που θα μπορούσαν να λειτουργήσουν ως φαρμακευτικοί στόχοι. Αρχικά, επιβεβαιώθηκε ότι κατά τη διαφοροποίηση με τον επαγωγέα HMBA ενεργοποιούνται μονοπάτια που συνδέονται με την καταστολή του κυτταρικού κύκλου και τη σύνθεση της αιμοσφαιρίνης, γεγονότα που αντικατοπτρίζουν τη μετάβαση προς το φαινότυπο του ώριμου ερυθροκυττάρου. Η ανάλυση του συνόλου των RAPs (Ribosome Associated Proteins), σε επίπεδο πρωτεΐνης και μεταγραφώματος ανέδειξε την αύξηση των RAPs που σχετίζονται με τη βιοσύνθεση της αίμης ενώ καταγράφηκε μείωση των RAPs που συμμετέχουν στην επεξεργασία του rRNA και στη βιογένεση των ριβοσωμάτων. Ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε στη μελέτη της πρωτεΐνης STEAP3, ως πιθανής RAP. Πριν από την έναρξη της διαφοροποίησης, η STEAP3 ανιχνεύθηκε στα μονοσώματα (80S) και στις ελεύθερες υπομονάδες (40S, 60S), όχι όμως στα πολυσώματα. Μετά την έναρξη της επαγωγής, δεν εντοπίστηκε πλέον σε κανένα από τα ριβοσωμικά κλάσματα. Επιπλέον, μέσω ανοσοκατακρήμνισης παρατηρήθηκε αλληλεπίδραση της STEAP3 με παράγοντες που εμπλέκονται στη μετάφραση (π.χ. EIF3a), γεγονός που υποδηλώνει έναν πιθανό νέο ρόλο της STEAP3, ως ρυθμιστή της μεταφραστικής δραστηριότητας. Η αποσιώπηση του γονιδίου Steap3 στα κύτταρα MEL οδήγησε σε εκτεταμένες μεταβολές τόσο στο μεταγραφικό όσο και στο πρωτεϊνικό προφίλ τους. Καταγράφηκε ενεργοποίηση διαφόρων δεικτών της ερυθροποίησης, αλλά και αύξηση ορισμένων επαγωγέων της φερρόπτωσης, σε συνδυασμό με μείωση ορισμένων αναστολέων της. Παράλληλα, διερευνήθηκε η δράση της ένωσης 001, ενός ανταγωνιστικού μορίου της STEAP3, η οποία εμφάνισε προφίλ παρόμοιο με την αποσιώπηση του γονιδίου. Αν και η ένταση της επίδρασης διαφοροποιήθηκε ανάλογα με τον υπό μελέτη δείκτη, η ένωση 001 προκάλεσε αξιοσημείωτη αύξηση της β-σφαιρίνης τόσο σε μεταγραφικό όσο και σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Το εύρημα αυτό ενδέχεται να υποδηλώνει ότι η ένωση 001 μπορεί να συμβάλλει στην έναρξη της διαφοροποίησης και αποτελεί υποσχόμενο μόριο για περαιτέρω μελέτη. Επιπλέον, διερευνήθηκαν δείκτες της φερρόπτωσης κατά τη διαφοροποίηση των κυττάρων MEL παρουσία του παράγοντα HMBA. Τα αποτελέσματα κατέδειξαν αύξηση ορισμένων επαγωγέων και μείωση ορισμένων αναστολέων της φερρόπτωσης, στοιχείο που ενισχύει την υπόθεση ότι η φερρόπτωση μπορεί να αποτελεί φυσιολογικό συνοδό μηχανισμό της ερυθροποίησης. Η υπόθεση αυτή εξετάστηκε περαιτέρω με τη χορήγηση της εραστίνης, γνωστού επαγωγέα της φερρόπτωσης, η οποία προκάλεσε ήπια αύξηση δεικτών της ερυθροποίησης. Ωστόσο, η ισχυρή στρεσογόνος δράση της φαίνεται να υπερκάλυψε την πιθανή διαφοροποιητική της ικανότητα. Συνολικά, στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η STEAP3 ως ένα ένζυμο με πολυδυάστατο ρυθμιστικό ρόλο που πιθανώς επηρεάζει τη διαδικασία της ερυθροποίησης, στο επίπεδο της μεταφραστικής ρύθμισης, της βιογένεσης ριβοσωμάτων και μέσα από την οδό της φερρόπτωσης. Παράλληλα, η ένωση 001 φαίνεται ένα υποσχόμενο μόριο ενδεχομένως με δυνατότητα να αξιοποιηθεί φαρμακολογικά. Τα ευρήματα αυτά δημιουργούν νέες προοπτικές για την ανάπτυξη στοχευμένων παρεμβάσεων σε διαταραχές της ερυθροποίησης.