Ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων και βιοαισθητήρων για την ανάλυση βιομορίων

Abstract

This Thesis aims to develop biosensing strategies, simple and multiplex, for liquid biopsy, with a particular focus on lateral flow assays (LFAs) for the detection of microRNAs. By integrating probe design optimization, enzymatic amplification-free methods, multiplex detection, and automated image analysis, it addresses key analytical challenges such as detectability, specificity, and matrix effects, while providing practical solutions for their application in clinical diagnostics. The first part of this thesis provides a comprehensive theoretical framework for liquid biopsy. Chapter 1 introduces the main classes of biomarkers and their biological and clinical significance. Chapter 2 reviews conventional analytical methods alongside biosensors, with particular emphasis on LFAs as rapid and user-friendly diagnostic tools. Chapter 3 addresses analytical challenges, including detectability, specificity, cross-reactivity, and matrix effects, while highlighting state-of-the-art solutions and remaining limitations. The second part describes the experimental contributions. Chapter 4 presents a universal and flexible method for microRNA detection in urine samples, combining RT-PCR technique with lateral flow assays. Biotinylated primers and gold nanoparticles conjugated with an antibody against biotin were used, allowing specific detection of miR-21 and miR-let-7a through hybridization with DNA probes. Detection was possible with the naked eye, simplifying the procedure. In Chapter 5, an amplification-free detection method was developed, in which a poly(A)polymerase activity was used to add a polyadenine tail to the 3' end of the target microRNA, allowing hybridization with a biotinylated probe and optical detection with gold nanoparticles. Using miR-let-7a as a model, the possibility of rapid and low-cost analysis without complex laboratory procedures was demonstrated. Chapter 6 presents the development of a lateral flow polyplex assay for the simultaneous detection of three miRNAs (miR-21, miR-let-7a and miR-155) integrated with automated image analysis for the automated qualitative and quantitative analysis. DNA probes complementary to the miRNAs were immobilized on the membrane of thevistrip, reducing the need for preliminary hybridization and thus simplifying the procedure. Evaluation of the strips was supported by an automated Python-based image processing algorithm, ensuring accurate analysis and reducing subjectivity of data interpretation. Finally, in Chapter 7, a novel multianalytical-multicolor biosensor was developed, where differently colored polystyrene microspheres were modified with DNA probes, allowing simultaneous analysis and visual discrimination of three miRNAs. This system was combined with an automated image analysis application for computers and mobile devices, providing real-time results, remote accessibility and minimizing human error.

Η παρούσα Διδακτορική Διατριβή στοχεύει στην ανάπτυξη καινοτόμων βιοαισθητήρων, απλών και πολλαπλών, με εφαρμογές στην υγρή βιοψία, με έμφαση στις δοκιμασίες πλευρικής ροής για την ανίχνευση miRNAs. Με την ενσωμάτωση βελτιστοποιημένου σχεδιασμού ιχνηθετών, ταχέων μεθόδων ανίχνευσης, πολυπλεξιακής προσέγγισης και χρήση εργαλείων αυτοματοποιημένης ανάλυσης εικόνας, η εργασία αυτή αντιμετωπίζει κρίσιμες αναλυτικές προκλήσεις στο χώρο της υγρής βιοψίας, όπως είναι η ανιχνευσιμότητα, η εκλεκτικότητα και οι επιδράσεις του βιολογικού υποστρώματος, προσφέροντας ταυτόχρονα πρακτικές λύσεις για την κλινική τους εφαρμογή. Στο πρώτο μέρος της διατριβής παρουσιάζεται το θεωρητικό υπόβαθρο. Στο Κεφάλαιο 1 εισάγονται ο όρος της υγρής βιοψίας, οι κύριες κατηγορίες βιοδεικτών και αναλύεται η βιολογική και κλινική τους σημασία, ενώ αναφέρονται συμβατικές μέθοδοι ανίχνευσής τους. Στο Κεφάλαιο 2 ανασκοπούνται καινοτόμες μέθοδοι ανάλυσης, με έμφαση στις δοκιμασίες πλευρικής ροής ως ταχείες, χαμηλού κόστους και φιλικές προς το χρήστη διαγνωστικές πλατφόρμες. Το Κεφάλαιο 3 επικεντρώνεται στις αναλυτικές προκλήσεις της υγρής βιοψίας και ιδιαίτερα στην ανάλυση των miRNAs: ανιχνευσιμότητα, εκλεκτικότητα διασταυρούμενη αντιδραστικότητα και επιδράσεις της μήτρας, αναδεικνύοντας τις τρέχουσες λύσεις αλλά και τα υφιστάμενα κενά. Στο δεύτερο μέρος περιγράφονται οι πειραματικές συνεισφορές. Στο Κεφάλαιο 4 παρουσιάζεται μία καθολική και ευέλικτη μέθοδος ανίχνευσης microRNAs σε δείγματα ούρων, συνδυάζοντας την τεχνική RT-PCR με τις δοκιμασίες πλευρικής ροής. Χρησιμοποιήθηκαν βιοτινυλιωμένοι εκκινητές και νανοσωματίδια χρυσού συζευγμένα με αντίσωμα έναντι της βιοτίνης, επιτρέποντας της ειδική ανίχνευσης των miR-21 και miR-let-7a μέσω υβριδοποίησης με DNA ανιχνευτές. Η ανίχνευση ήταν δυνατή με γυμνό μάτι, απλοποιώντας τη διαδικασία. Στο Κεφάλαιο 5 αναπτύχθηκε μία μέθοδος ανίχνευσης χωρίς ενίσχυση, όπου μέσω της δράσης της πολύ(Α) πολυμεράσης προστέθηκε ουρά πολυαδενίνης στο 3’ άκρο του microRNA-στόχου, επιτρέποντας την υβριδοποίηση με βιοτινυλιωμένο ανιχνευτή και την οπτική ανίχνευση με νανοσωματίδια χρυσού. Χρησιμοποιώντας ως μοντέλο τοivmiR-let-7a, αποδείχθηκε η δυνατότητα ταχείας και χαμηλού κόστους ανάλυσης, χωρίς πολύπλοκες εργαστηριακές διεργασίες.Στο Κεφάλαιο 6 παρουσιάζεται η ανάπτυξη πολυπλεξιακής δοκιμασίας πλευρικής ροής για την ταυτόχρονη ανίχνευση τριών miRNAs (miR-21, miR-let-7a και miR-155) σε συνδυασμό με αυτοματοποιημένο σύστημα ανάγνωσης των δοκιμασιών για αυτόματη ποιοτική, αλλά και ποσοτική ανάλυση. Στη μεμβράνη της δοκιμασίας πλευρικής ροής ακινητοποιήθηκαν DNA ανιχνευτές συμπληρωματικοί ως προς τα miRNAs, μειώνοντας την ανάγκη προκαταρκτικής υβριδοποίησης, απλοποιώντας τη διαδικασία. Η αξιολόγηση των ταινιών υποστηρίχθηκε από έναν αυτοματοποιημένο αλγόριθμο επεξεργασίας εικόνας βασισμένο σε Python, εξασφαλίζοντας ακριβή ανάλυση και μειώνοντας την υποκειμενικότητα κατά την επεξεργασία των αποτελεσμάτων. Τέλος, στο Κεφάλαιο 7 αναπτύχθηκε ένας καινοτόμος πολυαναλυτικός-πολυχρωματικός βιοαισθητήρας τύπου πλευρικής ροής, όπου διαφορετικά χρωματισμένα μικροσφαιρίδια πολυστυρενίου τροποποιήθηκαν με DNA ανιχνευτές, επιτρέποντας την ταυτόχρονη ανάλυση και οπτική διάκριση τριών miRNAs. Το σύστημα αυτό συνδυάστηκε με εφαρμογή αυτοματοποιημένης ανάλυσης εικόνας για υπολογιστές και κινητές συσκευές, παρέχοντας αποτελέσματα σε πραγματικό χρόνο, δυνατότητα απομακρυσμένης πρόσβασης και ελαχιστοποίηση του ανθρώπινου σφάλματος.