Ανάπτυξη μεθόδου για την in vivo ποσοτικοποίηση της ελεύθερης ρίζας υδροξυλίου στους οργανισμούς

Abstract

Hydroxyl radical (˙OH), the most active of the Reactive Oxygen Species (ROS), is characterized by its extremely short half-life (<1nsec) and exceptionally low steady-state concentrations in biological systems, due to its immediate and non-specific reactivity with almost all biomolecular targets. It is implicated in the initiation, progression, and even the clinical management of a wide spectrum of human pathologies. Due to the above its reliable detection and quantification has become both essential and technically challenging. Conventional, direct, detection approaches, such as electron spin resonance (ESR), are hindered by limited sensitivity and the necessity for the use of complex instruments. Among the array of the available chemical probes utilized for the indirect detection of ˙OH, the aromatic terephthalic acid (TPA) demonstrates notable advantages, especially because its reaction with ˙OH yields a highly fluorescent product, 2-hydroxyterephthalic acid (HTPA). However, TPA’s lack of membrane permeability and the interference of various biological components in the detection of HTPA have thus far prevented its application for the direct in vivo fluorometric quantification of ˙OH. In this doctoral thesis, the use of liposomal encapsulation to enhance the transmembrane cellular delivery of TPA is proposed, along with the investigation of a structurally modified TPA-analogue -monomethyl terephthalate (MMTPA)- as a potential ˙OH indirect probe. Finally, a robust method is presented for the efficient isolation and recovery of HTPA, to enable the quantitative assessment of ˙OH production in complex biological environments. These findings pave the way for potential biomedical applications in oxidative stress-related pathologies.

Η ελεύθερη ρίζα υδροξυλίου (˙OH) είναι η πιο δραστική από τις δραστικές μορφές οξυγόνου (ROS). Λόγω της ακαριαίας αντίδρασής της με όλα τα βιομόρια εμφανίζει εξαιρετικά βραχύβια ύπαρξη (<1 nsec) και ως εκ τούτου ιδιαίτερα χαμηλές συγκεντρώσεις εντός των βιολογικών συστημάτων. Εμπλέκεται δε σχεδόν σε όλες τις παθολογικές καταστάσεις, ως παράγοντας εμφάνισης, εξέλιξης, αλλά και πιθανής αντιμετώπισης νόσων του ανθρώπου. Τα παραπάνω καθιστούν την ανίχνευση και ποσοτικοποίησή της εξαιρετικά αναγκαία αλλά και δύσκολη. Οι παραδοσιακές μέθοδοι, όπως η άμεση ανίχνευση με ηλεκτρονικό παραμαγνητικό συντονισμό (ESR), παρουσιάζουν περιορισμούς ως προς την ποσοτική ευαισθησία και την τεχνική πολυπλοκότητα. Από τις μεθόδους χημικής ανίχνευσης, η έμμεση προσέγγιση ανίχνευσης της ˙OH με το αρωματικό τερεφθαλικό οξύ (TPA) υπερτερεί λόγω των φυσικοχημικών του χαρακτηριστικών. Η αντίδρασή του ΤΡΑ με την ˙OH παράγει ένα έντονα φθορίζον και εξειδικευμένο υδροξυλιωμένο προϊόν, το 2‑υδροξυτερεφθαλικό οξύ (HTPA). Ωστόσο, η μειωμένη δυνατότητα του TPA να διαπερνά κυτταρικές μεμβράνες, καθώς και η δυσκολία ανίχνευσης του HTPA εξαιτίας των παρεμβολών που οφείλονται στα κύτταρα, τους ιστούς ή τα όργανα, καθιστούν ανέφικτη (έως τώρα) την in vivo μελέτη και φθορισμομετρική ποσοτικοποίηση της • ΟΗ. Στην παρούσα Διδακτορική Διατριβή προτείνεται η χρήση λιποσωμικής ενθυλάκωσης για την ενίσχυση της διαπερατότητας του TPA μέσω των κυτταρικών μεμβρανών. Παράλληλα διερευνάται η χρήση ενός δομικά τροποποιημένου αναλόγου του TPA, του μονομεθυλ-τερεφθαλικού οξέος (monomethyl terephthalate ή MMTPA), ως δυνητικού ανιχνευτή της ˙OH. Τέλος, παρουσιάζεται μια αξιόπιστη μέθοδος για την αποτελεσματική απομόνωση και ανάκτηση του HTPA, με στόχο την ποσοτική αξιολόγηση της παραγωγής ˙OH σε πολύπλοκα βιολογικά περιβάλλοντα.