Διερεύνηση της φυσιολογίας θρέψης και διατροφής εκτρεφόμενων λαβρακιών με βιοτεχνολογικά επεξεργασμένα κτηνοτροφικά όσπρια

Abstract

The aquaculture sector continues to grow, playing a crucial role in providing high-quality food to meet global nutritional needs. However, the sustainability of the industry still faces significant challenges, with the most critical being its dependence on fishmeal (FM), which remains the primary source of high-value protein in aquafeeds. Additionally, the increased demand for imported plant-based alternative raw materials, primarily soy products, has been linked to environmental issues such as deforestation and the destruction of habitats for many animal species. Despite these concerns, imported soy remains a major protein source in aquafeeds, being the main plant-based ingredients typically used to replace FM. Sustainable aquaculture practices therefore require reducing the inclusion levels of FM in diets while simultaneously incorporating alternative protein sources that are produced with a significantly lower environmental footprint. Forage legumes can significantly enhance agricultural sustainability, serving as an important plant-based source of protein and energy while offering a favourable amino acid profile. However, the presence of antinutritional factors (ANFs) limits their use in aquafeeds, as they can inhibit the activity of digestive enzymes and/or reduce the bioavailability of dietary nutrients. In order to maximize the nutritional value and utilization efficiency of legumes, it is crucial to reduce or inactivate ANFs before their inclusion in aquafeeds. As legumes have become a promising alternative raw material for aquafeed formulation, particularly as fishmeal inclusion levels continue to decrease, various biotechnological processes, such as the application of exogenous enzymes and microorganisms, are being explored to optimize their nutritional profile and minimize ANF content. Among these, solid-state enzymatic hydrolysis (SSEH) and solid-state fermentation (SSF) have both been shown to improve the nutritional value of plant-based raw materials while simultaneously reducing their ANF content. In the present research, a literature review was initially conducted on locally produced legumes in Greece, followed by an evaluation of their nutritional profile and ANF content. Subsequently, research focused on identifying the exogenous enzymes commonly used in aquafeeds and their specific roles, as well as on exploring microorganisms suitable for application on solid substrates and their potential effects.The first in vitro experiment involved the application of SSEH. Three different combinations of exogenous enzymes were tested on three legume species under various processing conditions (moisture, temperature, pH, and time). The selected legumes were lupin (Lupinus albus), chickpea (Cicer arietinum), and faba bean (Favino faba). The enzyme mixtures included: (a) a multi-enzyme complex (ME) containing phytase, protease, xylanase, β-glucanase, cellulase, amylase, and pectinase; (b) a product containing xylanase, protease, and amylase (XPA); and (c) a combination of xylanase and phytase (XP). Each legume–enzyme combination was processed under: (i) standard conditions (8% moisture, 25 °C, 30 min), (ii) high moisture (45%), high temperature (50 °C), and extended duration (4 h), and (iii) two pH levels (natural and acidic). This process resulted in 27 enzymatic products, which were evaluated for protein content, changes in trypsin inhibitor levels, reduction in phytic acid and NSPs, and phosphorus release. Results showed that, in faba bean and chickpea, the processing conditions were the main factor reducing NSP levels, whereas in lupin both the enzyme composition and processing conditions played a significant role. Phytic acid reduction was most pronounced in the presence of phytase at pH 5.5 for all legume types. Phosphorus content increased in lupin hydrolysed with ME under high moisture and temperature. The combination of enzymatic and thermal treatment significantly reduced trypsin inhibitors in all tested legumes. Based on these findings, the enzymatic products showing the most promising changes were further evaluated for degree of protein hydrolysis (DH) to estimate protein digestibility. Lupin treated with the ME enzyme mixture exhibited the highest in vitro protein digestibility and was selected for use in the subsequent feeding trial.A total of 600 European sea bass (D. labrax, 11.2 ± 1.3 g) were used in the feeding trial. The fish were randomly distributed into 12 tanks (350 L each) and fed four experimental diets containing different ratios of soybean meal and enzymatically hydrolyzed lupin meal: Control (15% : 0%), Lupin 1 (5% : 7.5%), Lupin 2 (2.5% : 10%), and Lupin 3 (0% : 12.5%), for a period of 83 days, with three replicates per diet. The results showed significantly higher final body weight and specific growth rate (SGR), as well as a lower feed conversion ratio (FCR), in the group fed the Lupin 1 diet compared to the Control. The apparent digestibility coefficient (ADC) of crude protein was significantly higher in the Lupin 3 group, while the ADC of lipid was significantly higher in the Lupin 1 and Lupin 3 groups compared to the Control. Essential amino acid (EAA) deposition was highest in the Lupin 2 group, and a similar positive effect was observed for trypsin activity in both the pyloric caeca and intestine. Additionally, fish fed the enzymatically hydrolysed lupin meal showed an improved immune response, and no histopathological alterations were observed. Microbial diversity and abundance in the gut microbiota were also maintained, which is considered a key feature of sustainable dietary replacement. Overall, the findings demonstrated that solid-state enzymatically hydrolyzed lupin meal can completely replace soybean meal without negative impacts on growth performance. Furthermore, when included at 7.5%, it resulted in the best production performance.In the second in vitro experiment, SSF was applied. Specifically, three legumes (lupin, chickpea, and field pea) were selected as substrates for microbial inoculation. The microorganisms used for fermentation were Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, and Aspergillus niger. Different moisture levels, pH values, and fermentation durations were also tested. Solid-state fermentation produced 20 samples for each legume, which were analysed biochemically for nutritional value and reduction of antinutritional factors. In lupin, a significant increase in protein content was observed with A. niger (14–18%) and a 1–3% increase with S. cerevisiae and B. subtilis. The DH of protein increased significantly for all microorganisms, along with total phosphorus content, while phytic acid levels decreased significantly. Trypsin inhibitors were almost completely eliminated in all treatments. The DH of protein was highest with S. cerevisiae. Overall, A. niger showed the greatest effect on legume substrates, but its spore inactivation was not possible, so it was excluded from further evaluation. B. subtilis and S. cerevisiae showed similar effects, but B. subtilis required one extra day of fermentation, increasing production costs. Therefore, products derived from S. cerevisiae fermentation were further evaluated for NSP content. Results showed a significant reduction of NSP in lupin at 70% moisture and one day of fermentation. No significant changes were observed in chickpea, while NSP content increased in field pea. Based on the in vitro results, lupin fermented with S. cerevisiae was selected for the feeding trial due to its higher protein content, higher degree of protein hydrolysis, and greater reduction of NSP.A total of 600 European sea bass (D. labrax, 18.9 ± 2.2 g) were used in the feeding trial. Fish were randomly distributed into 12 tanks (350 L each) and fed four experimental diets containing different ratios of soybean meal and S. cerevisiae-fermented lupin meal: Control (15% : 0%), FRLUP 1 (5% : 10%), FRLUP 2 (2.5% : 12.5%), and FRLUP 3 (0% : 15%) for 71 days, with three replicates per diet. The results showed that growth performance indicators were not negatively affected when soybean meal was partially or fully replaced by fermented lupin meal. Replacing soybean with fermented lupin resulted in decrease in FCR and an increase in PER. Significantly higher protein and lipid ADC were observed in groups fed diets with high levels or total replacement of soybean meal by fermented lupin meal. Furthermore, trypsin activity in the pyloric caeca and intestine was significantly higher in all fermented lupin groups compared to the Control. A slight immunostimulatory effect was recorded in the FRLUP 2 group. The gut microbiota was dominated by Proteobacteria, Actinobacteria, and Firmicutes, a composition considered typical for sea bass. Overall, the results demonstrated that S. cerevisiae-fermented lupin effectively enhances the nutritional value of lupin and increases its potential as a sustainable substitute for soybean meal.After the completion of both feeding trials, trypsin activity in the pyloric caeca and intestine was evaluated for each experimental diet for a period of 24 hours. In both trials, 25 fish per tank were fed the respective diets at 2% of their body weight, and six fish per treatment were sampled at six different time points over a 24-hour period (0, 2, 4, 6, 8, and 24 h after feeding). In Experiment 1, trypsin activity in the pyloric caeca and intestine was consistently higher in the Lupin 1 group compared to the Control throughout the 24 h period. Lupin 2 and Lupin 3 groups showed significantly higher pyloric trypsin activity than the Control 6 h post-feeding. In Experiment 2, pyloric trypsin activity was significantly higher in all fermented lupin-fed groups up to 4 h after feeding, with FRLUP 1 maintaining higher activity even at 6 h. In the intestinal tract, trypsin activity remained higher at 6 h and 8 h post-feeding in all fermented lupin groups compared to the control. In both experiments, trypsin activity results indicated that lupin processed either by SSEH or by SSF led to elevated trypsin levels in the pyloric caeca and intestinal tract for most of the 24 h post-feeding period. In conclusion, the results of this study demonstrated that the applied biotechnological processes significantly improved the nutritional profile of legume meals by reducing antinutritional factors. The feeding trials confirmed that complete replacement of soybean meal with biotechnologically processed lupin meal is feasible without negatively affecting sea bass growth performance. Moreover, both low and high inclusion levels of processed lupin improved KPIs. The two biotechnological treatments also enhanced nutrient ADC, leading to improved feed utilization. A slight immunostimulatory effect was observed with the inclusion of processed ingredients, and trypsin activity significantly increased in the pyloric caeca and intestine, a finding closely linked to enhanced nutrient ADC. The application of such biotechnological processes could contribute to the sustainability of aquaculture by providing alternative raw materials to imported soybean meal while simultaneously supporting the agricultural sector.

Ο κλάδος των υδατοκαλλιεργειών έχει συνεχώς αυξανόμενη τάση, συμβάλλοντας καθοριστικά στην κάλυψη των αναγκών του πληθυσμού για υψηλής ποιότητας τρόφιμα. Ωστόσο η βιωσιμότητα του κλάδου συνεχίζει να αντιμετωπίζει σημαντικές προκλήσεις, με κυριότερη την εξάρτησή της στα ιχθυάλευρα (FM) που συνεχίζουν να αποτελούν την κύρια πηγή πρωτεϊνών υψηλής διατροφικής αξίας στις ιχθυοτροφές. Επιπρόσθετα, η αυξημένη ζήτηση εισαγόμενων εναλλακτικών πρώτων υλών φυτικής προέλευσης, κυρίως προϊόντων σόγιας, έχει συσχετιστεί με περιβαλλοντικά θέματα όπως την αποψίλωση των δασών αλλά και την καταστροφή ενδιαιτημάτων για πολλά είδη ζώων. Ωστόσο η εισαγόμενη σόγια παραμένει σημαντική πηγή πρωτεΐνης στις ιχθυοτροφές αποτελώντας το κυριότερο συστατικό φυτικής προέλευσης που αντικαθιστά το FM. Οι αειφόρες υδατοκαλλιεργητικές πρακτικές, λοιπόν, προϋποθέτουν τη μείωση των επιπέδων συμπερίληψης των FM στις τροφές με ταυτόχρονη χρήση εναλλακτικών πηγών πρωτεϊνών που παράγονται με σαφώς χαμηλότερο περιβαλλοντικό αποτύπωμα. Τα κτηνοτροφικά όσπρια (ψυχανθή) μπορούν να προωθήσουν τη βιωσιμότητα της γεωργίας, αποτελούν σημαντική φυτική πηγή πρωτεΐνης και ενέργειας και παρουσιάζουν πολύ καλό προφίλ αμινοξέων (AA). Ωστόσο η παρουσία αντιδιατροφικών παραγόντων (ANFs, Antinutritional factors) περιορίζει την χρήση τους στις ιχθυοτροφές καθώς έχουν την ιδιότητα να παρεμποδίζουν τη δράση των πεπτικών ενζύμων ή/και να μειώνουν τη βιοδιαθεσιμότητα των θρεπτικών συστατικών της τροφής. Για να μεγιστοποιηθεί η διατροφική αξία και η αποδοτικότητα χρήσης των οσπρίων, είναι ζωτικής σημασίας να μειωθούν ή να αδρανοποιηθούν οι ANFs όταν χρησιμοποιούνται ως συστατικά στις ιχθυοτροφές. Καθώς λοιπόν τα όσπρια έχουν γίνει μια πολλά υποσχόμενη εναλλακτική πρώτη ύλη για την συμπερίληψη τους στις ιχθυοτροφές, και ενώ ταυτόχρονα έχουν αλλάξει σημαντικά τα επίπεδα των FM στην κατάρτιση των σιτηρεσίων, ποικίλες βιοτεχνολογικές διεργασίες, όπως η εφαρμογή εξωγενών ενζύμων αλλά και η χρήση μικροοργανισμών, εφαρμόζονται για την βελτιστοποίηση του διατροφικού τους προφίλ και τη μείωση των ANFs που περιέχουν. Τέτοιες βιοτεχνολογικές διεργασίες είναι η ενζυμική υδρόλυση στερεάς φάσης (SSEH, Solid state enzymatic hydrolysis) και η ζύμωση στερεάς φάσης (SSF, Solid state fermentation). Και για τις δύο βιοτεχνολογικές διεργασίες έχει τεκμηριωθεί, ότι βελτιώνουν τη θρεπτική αξία των φυτικών πρώτων υλών ενώ ταυτόχρονα μειώνουν τα επίπεδα των ANF. Στην παρούσα έρευνα, αρχικά, πραγματοποιήθηκε βιβλιογραφική ανασκόπηση αναφορικά με τα τοπικά παραγόμενα όσπρια της Ελλάδας και στην συνέχεια ακολούθησε αξιολόγηση του διατροφικού προφίλ τους καθώς και των επιπέδων των ANF. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε έρευνα σχετικά με τα εξωγενή ένζυμα που χρησιμοποιούνται στις ιχθυοτροφές καθώς και τον στόχο εφαρμογής του καθενός. Και επιπλέον ερευνήθηκαν οι μικροοργανισμοί που μπορούν να εφαρμοστούν σε στέρεα υποστρώματα και η πιθανή επίδραση τους.Στο πρώτο in vitro πείραμα που πραγματοποιήθηκε εφαρμόστηκε SSEH. Συνολικά αξιολογήθηκαν τρεις διαφορετικοί συνδυασμοί εξωγενών ενζύμων σε τρία διαφορετικά όσπρια υπό διαφορετικές συνθήκες επεξεργασίας (υγρασίας, θερμοκρασίας, pH και χρόνου). Τα όσπρια που επιλέχθηκαν να εφαρμοστεί η SSEH ήταν το λούπινο (Lupinus albus), το ρεβίθι (Cicer arietinum) και το κουκί (Favino faba). Τα εξωγενή ένζυμα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ένα μίγμα εξωγενών ενζύμων (ΜΕ) που περιείχε φυτάση, πρωτεάση, ξυλανάση, β-γλουκανάση, κυτταρινάση, αμυλάση και πηκτινάση, ένα προϊόν εξωγενών ενζύμων που περιείχε ξυλανάση, πρωτεάση και αμυλάση (ΞΠΑ), και ενας συνδυασμός εξωγενών ενζύμων ξυλανάσης και φυτάσης (ΞΦ). Το κάθε όσπριο με το κάθε μίγμα εξωγενών ενζύμων επεξεργάστηκε α) σε φυσιολογικές συνθήκες (ΦΣ) υγρασίας (8%), θερμοκρασίας (25℃) και διάρκειας (30 λεπτών), β) σε υψηλά επίπεδα υγρασίας (45%), θερμοκρασίας (50℃) και διάρκειας (4 ωρών) και γ) σε δύο διαφορετικά επίπεδα pH (φυσικό και όξινο). Από την βιοτεχνολογική αυτή διαδικασία προέκυψαν 27 προϊόντα ενζυμικής υδρόλυσης τα οποία αξιολογήθηκαν ως προς τα επίπεδα πρωτεΐνης, την μεταβολή των αναστολέων θρυψίνης, την μείωση των επιπέδων του φυτικού οξέος και των ΜΑΠ αλλά και για την αύξηση του φωσφόρου. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως στο κουκί και στο ρεβίθι ο παράγοντας επεξεργασία ήταν ο κύριος λόγος μείωσης των επιπέδων των ΜΑΠ ενώ στο λούπινο ο παράγοντας ένζυμα και επεξεργασία. Στα επίπεδα του φυτικού οξέος παρατηρήθηκε μεγαλύτερη μείωση με την παρουσία της φυτάσης στα εξωγενή ένζυμα και σε pH 5.5 για όλα τα είδη οσπρίων. Ο φώσφορος του λούπινου αυξήθηκε έπειτα από την ενζυμική υδρόλυση με το ΜΕ στα υψηλά επίπεδα υγρασίας και θερμοκρασίας. Ο συνδυασμός ενζύμων και θερμικής επεξεργασίας μείωσε τους αναστολείς θρυψίνης σε όλα τα δοκιμασμένα όσπρια. Κατόπιν της αξιολόγησης τα πιο εμφανώς θετικά μεταβαλλόμενα ενζυμικά προϊόντα αξιολογήθηκαν περαιτέρω μέσω ανάλυσης του βαθμού υδρόλυσης (DH, degree hydrolysis) των πρωτεϊνών στοχεύοντας στην εκτίμηση της πεπτικότητας της πρωτεΐνης. Το λούπινο επεξεργασμένο με τα εξωγενή ένζυμα ΜΕ παρουσίασε την υψηλότερη in vitro πεπτικότητα πρωτεΐνης και επιλέχθηκε να χρησιμοποιηθεί στην πειραματική εκτροφή.Στην πειραματική εκτροφή χρησιμοποιήθηκαν εξακόσια λαβράκια (Dicentrarchus labrax) (11,2 ± 1,3g) τα οποία κατανεμήθηκαν σε 12 δεξαμενές των 350 λίτρων η καθεμία και σιτίστηκαν τα τέσσερα πειραματικά σιτηρέσια όπου περιείχαν διαφορετικές αναλογίες σόγιας και ενζυμικά επεξεργασμένου λούπινου: Control (15% : 0%), Lupin 1 (5% :7,5%), Lupin 2 (2,5% : 10%) και Lupin 3 (0% : 12,5%) για περίοδο 83 ημερών εις τριπλούν ανά δίαιτα. Τα αποτελέσματα έδειξαν υψηλότερο τελικό σωματικό βάρος και ειδικό ρυθμό ανάπτυξης (SGR) και χαμηλότερη συντελεστή μετατρεψιμότητας της τροφής (FCR, Feed conversion ratio) για την ομάδα που σιτίστηκε με την δίαιτα Lupin 1 συγκριτικά με την Control. Σημαντικά υψηλότερος συντελεστής φαινομενικής πεπτικότητας (ADC, Apparent digestibility coefficient) της πρωτεΐνης παρατηρήθηκε στην ομάδα Lupin 3, ενώ η ADC του λίπους ήταν σημαντικά υψηλότερη για τις ομάδες Lupin 1 και Lupin 3 σε σύγκριση με την Control. Η εναπόθεση των απαραίτητων αμινοξέων (EAA Essential amino acids) ήταν υψηλότερη στην ομάδα Lupin 2 ενώ παρόμοια θετική επίδραση παρατηρήθηκε και στην ενεργότητα της θρυψίνης στα πυλωρικά τυφλά και τον έντερο των ιχθύων. Θετική επίδραση καταγράφηκε στην ανοσολογική απόκριση των ιχθύων που σιτίστηκαν με το λούπινο ενζυμικής υδρόλυσης και δεν παρατηρήθηκαν ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις. Επιπρόσθετα, παρατηρήθηκε διατήρηση της μικροβιακής ποικιλότητας και αφθονίας στο εντερικό μικροβίωμα γεγονός που θεωρείται ως χαρακτηριστικό βιώσιμης διατροφικής αντικατάστασης. Ολιστικά τα ευρήματα υπέδειξαν πως το λούπινο SSEH μπορεί να αντικαταστήσει πλήρως το άλευρο σόγιας χωρίς αρνητικές επιδράσεις στους παραγωγικούς δείκτες ανάπτυξης (KPI, Key production indices). Όταν δε συμπεριληφθεί σε ποσοστό 7,5% παρουσιάζεται καλύτερη επίδοση των παραγωγικών δεικτών.Στο δεύτερο in vitro πείραμα εφαρμόστηκε SSF. Αναλυτικότερα, επιλέχθηκαν τρία όσπρια (λούπινο, ρεβίθι, μπιζέλι) ως υπόστρωμα για την εφαρμογή μικροοργανισμών. Για την SSF επιλέχθηκαν οι μικροοργανισμοί Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae και Aspergillus niger. Χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικά επίπεδα υγρασίας, pH καθώς και διάρκειας ζύμωσης. Από την εφαρμογή ζύμωσης στερεάς φάσης προέκυψαν 20 προϊόντα για κάθε όσπριο, τα οποία αξιολογήθηκαν με βιοχημικές αναλύσεις ως προς την διατροφική τους αξία αλλά και την μείωση των ANF. Τα ευρήματα στο λούπινο έδειξαν σημαντική αύξηση των επιπέδων πρωτεΐνης με την εφαρμογή του μικροοργανισμού A. Niger (14-18%) και αύξηση 1-3% για τους μικροοργανισμούς S. cerevisiae και B. subtilis. Παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση στον DH των πρωτεϊνών για όλες τις περιπτώσεις μικροοργανισμών, αλλά και του ολικού φωσφόρου καθώς και σημαντική μείωση των επιπέδων φυτικού οξέος. Καθοριστική ήταν και η επίδραση στους αναστολείς θρυψίνης, σχεδόν μηδενίζοντας τα επίπεδα τους σε όλες τις περιπτώσεις. Ο DH των πρωτεϊνών βρέθηκε να αυξάνεται περισσότερο με την εφαρμογή του S. cerevisiae. Στα επίπεδα του φυτικού οξέος παρατηρήθηκε μείωση μόνο με την εφαρμογή των μικροοργανισμών A. niger και B. subtilis. Αντιθέτως στον ολικό φώσφορο παρατηρήθηκε αύξηση των επιπέδων του με την εφαρμογή και των τριών μικροοργανισμών. Οι αναστολείς θρυψίνης μειώθηκαν σημαντικά σε όλες τις επεξεργασίες ζύμωσης. Στα επίπεδα πρωτεΐνης του μπιζελιού παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση με την εφαρμογή του A. niger ενώ για τους άλλους δύο μικροοργανισμούς σημειώθηκε μείωση ή καμία επίδραση κατά περίπτωση των συνθηκών επεξεργασίας. Ο DH των πρωτεϊνών βρέθηκε να αυξάνεται περισσότερο με την εφαρμογή του S. cerevisiae. Η μεγαλύτερη επίδραση, στα υποστρώματα οσπρίων, παρατηρήθηκε από τον μικροοργανισμό A. niger, ωστόσο η απενεργοποίηση των σπορίων του ήταν αδύνατη με αποτέλεσμα να μην επιλεχθεί για περαιτέρω αξιολόγηση. Ο B. subtilis και ο S. cerevisiae, παρουσίασαν παρόμοια επίδραση στα υποστρώματα, ωστόσο η αποτελεσματικότητα του B. subtilis απαιτούσε μία ημέρα επιπλέον ζύμωσης, γεγονός που αυξάνει το κόστος παραγωγής της πρώτης ύλης. Τα προϊόντα που προέκυψαν έπειτα από την ζύμωση με τον S.cerevisiae επιλέχθηκαν να αξιολογηθούν περαιτέρω ως προς τα επίπεδα των ΜΑΠ. Τα ευρήματα στο λούπινο έδειξαν σημαντική μείωση των ΜΑΠ σε ποσοστό υγρασίας 70% και στη 1 ημέρα ζύμωσης. Στο ρεβίθι δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές, ενώ στο μπιζέλι παρατηρήθηκε αύξηση των επιπέδων των ΜΑΠ. Παρατηρώντας ολιστικά τα αποτελέσματα της in vitro αξιολόγησης, επιλέχθηκε για την πειραματική εκτροφή, το λούπινο ζυμωμένο με τον S. cerevisiae, λόγω των υψηλότερων επιπέδων πρωτεΐνης, του υψηλού DH των πρωτεϊνών καθώς και της μεγαλύτερης μείωσης των ΜΑΠ.Στην συνέχεια ακολούθησε η πειραματική εκτροφή όπου χρησιμοποιήθηκαν εξακόσια λαβράκια (D. labrax) (18,9 ± 2,2g) τα οποία κατανεμήθηκαν σε 12 δεξαμενές των 350 λίτρων, η καθεμία, και σιτίστηκαν τα τέσσερα πειραματικά σιτηρέσια όπου περιείχαν διαφορετικές αναλογίες σόγιας και ζυμωμένου λούπινου με τον S. cerevisiae: Control (15% : 0%), FRLUP 1 (5% :10%), FRLUP 2 (2,5% : 12,5%) και FRLUP 3 (0% : 15%) για περίοδο 71 ημερών εις τριπλούν ανά δίαιτα. Τα αποτελέσματα έδειξαν να μην επηρεάζονται οι KPI όταν η σόγια αντικαθιστάτε μερικώς ή ολικώς από το ζυμωμένο λούπινο. Η αντικατάσταση της σόγιας με άλευρο λούπινου που είχε υποστεί ζύμωση οδήγησε σε μείωση του FCR και αύξηση του συντελεστή αποδοτικότητας πρωτεΐνης (PER, Protein efficiency ratio). Καταγράφηκε σημαντικά υψηλότερη ADC πρωτεΐνης και λίπους στις ομάδες που σιτίστηκαν με υψηλά επίπεδα ή αποκλειστικά με ζυμωμένο άλευρο λούπινου. Επιπλέον, εντοπίστηκε ανεβασμένη ενεργότητα θρυψίνης στα πυλωρικά τυφλά και στο έντερο των ομάδων που σιτίστηκαν με το ζυμωμένο λούπινο συγκριτικά με την Control. Στην περίπτωση της ομάδας που σιτίστηκε με την δίαιτα FRLUP 2 παρατηρήθηκε μικρή ανοσοδιέγερση. Η βακτηριακή κοινότητα, παρατηρήθηκε, να κυριαρχείται, σε επίπεδο φύλου, από τα Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes, παρουσία που είναι φυσιολογική στο λαβράκι (D. labrax). Τα συνολικά αποτελέσματα έδειξαν την ικανότητα του ζυμωμένου λούπινου με τον S. cerevisiae να βελτιώνει την διατροφική αξία του λούπινου, ενισχύοντας την πιθανότητα αντικατάστασης του άλευρου σόγιας από την συγκεκριμένη ζυμωμένη πρώτη ύλη.Μετά την λήξη των δύο πειραματικών εκτροφών ακολούθησε για κάθε πειραματική εκτροφή αξιολόγηση της ενεργότητας της θρυψίνης στα πυλωρικά τυφλά και στο έντερο των ιχθύων έπειτα από σίτιση με τα πειραματικά σιτηρέσια της κάθε εκτροφής. Και στις δύο περιπτώσεις των πειραματικών δοκιμών, 25 άτομα ανά δεξαμενή σιτίστηκαν με τις πειραματικές τροφές σε ποσοστό 2% του σωματικού τους βάρους και ακολούθησαν δειγματοληψίες σε 6 άτομα ανά πειραματικό σιτηρέσιο, για 6 διαφορετικά χρονικά σημεία κατά την διάρκεια 24ωρών ώστε να καλυφθούν οι χρόνοι 0, 2, 4, 6, 8 και 24 ώρες μετά την πρόσληψη της τροφής. Στο πείραμα 1 (SSEH) παρατηρήθηκε υψηλότερη δράση της θρυψίνης στα πυλωρικά τυφλά και το έντερο της ομάδας Lupin 1 συγκριτικά με την Control σε όλο το 24ωρο μετά τη σίτιση. Οι ομάδες Lupin 2 και Lupin 3 παρουσίασαν πιο υψηλή δράση της θρυψίνης στα πυλωρικά τυφλά συγκριτικά με την Control στις 6 ώρες μετά την σίτιση. Στο Πείραμα 2 (SSF), η ενεργότητα της θρυψίνης στα πυλωρικά τυφλά ήταν υψηλότερη σε όλες τις ομάδες που σιτίστηκαν με το ζυμωμένο λούπινου συγκριτικά με την Control μέχρι και τις 4 ώρες μετά την σίτιση. Η FRLUP 1 συνέχισε να έχει υψηλότερη δράση και στις 6 ώρες μετά την σίτιση. Στον εντερικό σωλήνα, υψηλότερη ενεργότητα της θρυψίνης, παρατηρήθηκε στις 6 και 8 ώρες μετά την σίτιση για τις ομάδες που σιτίστηκαν με το ζυμωμένο λούπινο συγκριτικά με την Control. Και στα δύο πειράματα τα αποτελέσματα της ενεργότητας της θρυψίνης οδήγησαν στο συμπέρασμα πως το λούπινο επεξεργασμένο είτε με SSEH, είτε με SSF παρουσιάζει υψηλότερα επίπεδα θρυψίνης στα πυλωρικά τυφλά και στον εντερικό σωλήνα του λαβρακιού στη μεγαλύτερη διάρκεια του 24ώρου.Συμπερασματικά τα ευρήματα της παρούσας έρευνας έδειξαν πως οι βιοτεχνολογικές διεργασίες που εφαρμόστηκαν επιδρούν σημαντικά στο διατροφικό προφίλ των οσπρίων βελτιώνοντας την θρεπτική τους αξία μέσω της μείωσης των ANF. Στις πειραματικές εκτροφές επιβεβαιώθηκε πως η ολική αντικατάσταση του άλευρου σόγιας από βιοτεχνολογικά επεξεργασμένο άλευρο λούπινου είναι εφικτή χωρίς να επιδρά αρνητικά στους KPI του λαβρακιού (D.labrax). Και στη περίπτωση της χαμηλής ή υψηλής αντικατάστασης του άλευρου σόγιας από βιοτεχνολογικά επεξεργασμένο άλευρο λούπινου να παρατηρείται βελτίωση των παραγωγικών δεικτών ανάπτυξης. Επιπρόσθετα οι δύο βιοτεχνολογικές διεργασίες που εφαρμόστηκαν αύξησαν την πεπτικότητα των θρεπτικών συστατικών γεγονός που οδήγησε σε καλύτερη αξιοποίηση της τροφής. Παρατηρήθηκε μικρή ανοσοδιέγερση με την προσθήκη των βιοτεχνολογικών πρώτων υλών και σημαντική αύξηση της δράσης της θρυψίνης στα πυλωρικά τυφλά και στο έντερο, εύρημα που μπορεί να συνδεθεί με την υψηλή πεπτικότητα θρεπτικών συστατικών. Η εφαρμογή αυτών των βιοτεχνολογικών διεργασιών μπορεί να συνεισφέρει στην βιωσιμότητα του κλάδου προσφέροντας εναλλακτικές πρώτες ύλες της εισαγόμενης σόγιας και ταυτόχρονα να ενισχύσει ένα επιπλέον κλάδο του πρωτογενή τομέα, την γεωργία.