Ανάπτυξη οπτικών ανοσοαισθητήρων για τον προσδιορισμό καρκινικών δεικτών σε δείγματα ανθρώπινου ορού αίματος

Abstract

Ovarian cancer is one of the most aggressive forms of female reproductive system cancers, with high mortality rates due to its late diagnosis. One approach to achieve early cancer diagnosis is to determine the concentrations of relevant biomarkers in biological fluids, mainly blood serum. As these markers have very low concentrations, there is an urgent need for the development of sensitive, specific and rapid methods for their determination. In this frame, this thesis focuses on the development of high-sensitivity optical immunosensors, based on Surface-Enhanced Raman Spectroscopy (SERS) and Surface-Enhanced Fluorescence (SEF) techniques, for the detection of three cancer markers, CA125, HE4, and survivin (BIRC5), in human serum related to ovarian cancer diagnosis. The developed biosensors are based on non-competitive sandwich-type immunoassays, using specialized antibodies and appropriate labels in combination with substrates with meal nanostructures. All the critical parameters of the two methods were optimized, including substrate selection, reagents concentration, and duration of each assay step. The achieved detection limits were 2.5 U/mL for CA125, 3.12 pM for HE4, and 12.5 pg/mL of BIRC5, with linear response ranges 5–500 U/mL, 6.25–500 pM, and 25–500 pg/mL, respectively. In addition, the immunosensors developed were compared with the methods currently employed for the determination of the three markers in diagnostic labs. This comparison demonstrated the applicability of the developed optical immunosensors in routine clinical analysis, as they provide a flexible, rapid and highly sensitive diagnostic platform for the determination of cancer markers related to early detection of ovarian cancer.

Ο καρκίνος των ωοθηκών παραμένει μία από τις πιο επιθετικές μορφές καρκίνου του γυναικείου αναπαραγωγικού συστήματος, με υψηλά ποσοστά θνησιμότητας λόγω της -μη έγκαιρης διάγνωσης του. Μια από τις προσεγγίσεις που ακολουθούνται για να επιτευχθεί η έγκαιρη διάγνωση είναι ο προσδιορισμός διαφόρων βιοδεικτών σε βιολογικά υγρά και κυρίως σε ορό αίματος. Ωστόσο, η ανίχνευση των βιοδεικτών αυτών, λόγω των χαμηλών επιπέδων τους στα βιολογικά υγρά, απαιτεί την ανάπτυξη νέων διαγνωστικών μεθόδων που να ποσοτικοποιούν τους βιοδείκτες με υψηλή ευαισθησία και αξιοπιστία. Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάζει στην ανάπτυξη οπτικών ανοσοαισθητήρων υψηλής ευαισθησίας, βασισμένων στις τεχνικές ενισχυόμενης από την επιφάνεια φασματοσκοπίας Raman (SERS) και ενισχυόμενου από την επιφάνεια φθορισμού (SEF), για την ανίχνευση τριών καρκινικών δεικτών, CA125, HE4 και σουρβιβίνης (BIRC5), που σχετίζονται με τον καρκίνο των ωοθηκών σε δείγματα ανθρώπινου ορού. Οι αισθητήρες που αναπτύχθηκαν βασίζονται σε μη ανταγωνιστικό ανοσοπροσδιορισμό τύπου «sandwich» με χρήση εξειδικευμένων αντισωμάτων και κατάλληλων ιχνηθετών σε συνδυασμό με υποστρώματα με μεταλλικές νανοδομές. Βελτιστοποιήθηκαν όλες οι κρίσιμες παράμετροι των δύο μεθόδων όπως η επιλογή υποστρωμάτων και των ιχνηθετών, η συγκέντρωση των αντιδραστηρίων, η χρονική διάρκεια όλων των σταδίων. Τα όρια ανίχνευσης που επιτεύχθηκαν και με τις δύο μεθόδους ανίχνευσης ήταν 2.5 U/mL για το CA125, 3.12 pM για την HE4 και 12.5 pg/mL για την BIRC5, ενώ οι δυναμικές περιοχές ανίχνευσης ήταν 5–500 U/mL, 6.25–500 pM και 25–500 pg/mL, αντίστοιχα. Επιπλέον, οι μέθοδοι που αναπτύχθηκαν συγκρίθηκαν με τις μεθόδους που εφαρμόζονται σε διαγνωστικά εργαστήρια. Η σύγκριση αυτή κατέδειξε τη δυνατότητα εφαρμογής των αναπτυχθέντων οπτικών ανοσοαισθητήρων σε αναλύσεις ρουτίνας, παρέχοντας μία ευέλικτη, ταχεία και υψηλής ευαισθησίας διαγνωστική πλατφόρμα για τον προσδιορισμό βιοδεικτών που σχετίζονται με πρώιμη ανίχνευση του καρκίνου των ωοθηκών.