In vivo πειραματική μελέτη της οστεοεπαγωγικής ικανότητας του πεπτιδίου 3 της οστικής μορφογενετικής πρωτεΐνης-2

Abstract

Aim and scope: Despite bone’s considerable potential for regeneration and remodelling, in everyday clinical practice, Orthopaedics have to face fracture non-union and large bone defects needing grafting much more common than previously. Aim of the present Thesis is to confirm in vivo the osteoinduction and safety of a novel and promising growth factor, called Peptide 3, which is a 10-mer peptide derived from BMP-2, as well as to provide evidence of non-inferiority in comparison with BMP-2 itself. Moreover, a series of novel gelatin sponges have been studied aiming to provide a new combination that could be used as a future bone graft. Materials and Methods: 27 male adult white Wistar rats have been used in the present Thesis, in an ectopic ossification model. Pilot studies were performed initially to check and confirm the materials used and various factors during the experimental process. Best procedure was verified. Main part of the in vivo experiments included a comparison of osteoinduction between Peptide 3 and BMP-2 in combination with collagen (Helistat®) and gelatin B sponges (intercalated and not). Last part of the experiments included materials that could be the basis for future research. Regarding the main part of the study, 150μg Peptide 3 or 25μg BMP-2 were combined with Helistat® collagen sponges, Gelatin B 5% sponges and intercalated Gelatin materials, forming eight groups. On day 0, following intra-peritoneal anaesthesia, four intramuscular pockets were created at the dorsum of the rats. Final implants were a combination of sponge and growth factor, as mentioned above. Each rat lived in an individual cage under constant temperature and humidity conditions, followed a fixed light-dark cycle (every 12 hours) and had ad libitum access to standard food and fresh water. After four weeks (day 28), rats were killed by carbon dioxide inhalation, while the final preparations resulting from the removal of the materials were observed under the light microscope after staining with hematoxylin-eosin. A total of 16 factors were studied and recorded, including material remnants, presence of inflammation and cells, neovascularization and fibrosis, presence of osteoid, newly formed ectopic bone tissue and bone marrow. Results: No local or generalized reactions to the materials or any impairment in the healing of the surgical wound were observed. There was one animal loss during the experiments which was caused as a complication of anaesthesia. No statistically significant difference was observed between Peptide 3 and BMP-2 in any of the parameters studied either in their combination with Helistat® or with the Gelatin B 5% sponges. On the contrary, the combination of growth factors (25μg BMP-2 or 150μg Peptide 3) with the Gelatin B 5% sponges showed significantly more newly formed ectopic bone tissue compared to the use of Helistat® (p=0.03 and 0.04 respectively). In addition, the Gelatin B groups showed significantly more residual material elements, while the Peptide 3 and Gelatin combination showed more evidence of inflammation and neovascularization. Finally, the intercalated sponges, whether carrying BMP-2 or Peptide 3, showed significantly more ectopic ossification, neovascularization and the presence of osteoblasts compared to the combination of Helistat® with BMP-2. All ossification variables that could be statistically processed (newly formed bone, presence of osteoblasts, osteoclasts and bone marrow) showed a significant positive correlation with the scaffold used, residual material and neovascularization. Conclusion: The pilot experiments confirmed the safety and osteoinductive properties of Peptide 3, while the main part of the study demonstrated its non-inferiority to BMP-2, at the doses used. In particular, the combination of Peptide 3 with the 5% Gelatin B sponges, and especially the intercalated ones, demonstrated remarkable osteoinductive properties and osteoconductivity. We hope that the above material will constitute an important milestone in the development of Bone Engineering.

Σκοπός: Παρά τις εξαιρετικές αναγεννητικές ικανότητες του οστίτη ιστού, στη σύγχρονη κλινική πρακτική, η Ορθοπαιδική κονότητα έρχεται αντιμέτωπη ολοένα και συχνότερα με την ανάγκη αντιμετώπισης ψευδαρθρώσεων και κάλυψης μεγάλων οστικών ελλειμάτων, καταστάσεις που απαιτούν τη χρήση οστικών μοσχευμάτων. Σκοπός της παρούσας διατριβής αποτελεί η in vivo επιβεβαίωση της οστεοεπαγωγικής ικανότητας αλλά και της ασφάλειας ενός νέου και πολλά υποσχόμενου αυξητικού παράγοντα που ονομάζεται Πεπτιδίο 3 και αποτελεί ένα πεπτίδιο μήκους 10 καταλοίπων αμινοξέων προερχόμενο από την BMP-2, καθώς και η κατάδειξη της μη κατωτερότητάς του σε σχέση με ολόκληρο το μόριο της πρωτεϊνης. Επιπλέον, η παρούσα διατριβή αποσκοπεί στη μελέτη μιας σειράς σπόγγων Ζελατίνης Β και την ανάδειξη ένος συνδυασμού που θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως μελλοντικό μόσχευμα. Υλικά και Μέθοδος: Για την παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 27 ενήλικες αρσενικοί λευκοί επίμυες Wistar σε ένα μοντέλο έκτοπης οστεοποίησης. Αρχικά πραγματοποίηθηκαν πιλοτικά πειράματα για τον έλεγχο διαφόρων παραμέτρων της διαδικασίας αλλά και των υλικών και να καθοριστούν οι βέλτιστες συνθήκες. Στη συνέχεια, το κύριο τμήμα του in vivo πειράματος περιελάμβανε τη σύγκριση της οστεοεπαγωγικότητας του Πεπτιδίου 3 με σχέση με τη BMP-2 σε συνδυασμό με ικριώματα κολλαγόνου (Helistat®) και Ζελατίνης Β (intercalated και μη), ενώ στο τέλος ελέχθηκαν υλικά που θα αποτελέσουν τη βάση μελλοντικής έρευνας. Όσον αφορά το κύριο τμήμα του πειράματος, χρησιμοποιήθηκαν 150μg Πεπτιδίου 3 ή 25μg BMP-2 σε συνδυασμό με σπόγγους κολλαγόνου Helistat®, σπόγγους Ζελατίνης Β 5% και intercalated ικριώματα Ζελατίνης Β, σχηματίζοντας συνολικά οκτώ ομάδες. Την ημέρα «0» του πειράματος, μετά από χορήγηση κατάλληλης αναισθησίας ενδοπεριτοναϊκά, σχηματίστηκαν 4 ενδομυϊκοί θύλακοι στη ράχη των επίμυων, όπου τοποθετήθηκαν τα τελικά υλικά τα οποία αποτελούνταν από ένα συνδυασμό ικριώματος και αυξητικού παράγοντα. Στη ράχη του, κάθε επίμυς έφερε συνήθως διαφορετικά υλικά. Κάθε επίμυς διαβιούσε σε ξεχωριστό κλωβό υπό σταθερές συνθήκες θερμοκρασίας και υγρασίας, ακολουθούσαν σταθερό κύκλο εναλλαγής φωτός-σκότους (ανά 12 ώρες) και είχαν ad libitum πρόσβαση σε τυποποιημένη τροφή και φρέσκο νερό. Μετά από τέσσερις εβδομάδες (ημέρα 28) οι επίμυες θανατώνονταν με εισπνοή διοξειδίου του άνθρακα, ενώ τα τελικά παρασκευάσματα που προέκυπταν από την αφαίρεση των υλικών μονιμοποιούνταν και παρατηρούνταν στο οπτικό μικροσκόπιο μετά από χρώση τους με αιματοξυλίνη-εωσίνη. Μελετήθηκαν και καταγράφηκαν συνολικά 16 παράγοντες, μεταξύ των οποίων τα υπολείμματα του υλικού, η παρουσία φλεγμονής και κυττάρων, η νεαγγείωση και ίνωση, η παρουία οστεοειδούς, νεοσχηματισμένου οστίτη ιστού και οστικού μυελού. Αποτελέσματα: Δεν παρατηρήθηκαν τοπικές ή γενικευμένες αντιδράσεις στα υλικά ή κάποια διαταραχή στην επούλωση του χειρουργικού τραύματος. Υπήρξε μία απώλεια ζώου κατά τη διάρκεια των πειραμάτων η οποία προκλήθηκε ως επιπλοκή από την αναισθησία. Δεν παρατηρήθηκε κάποια στατιστικώς σημαντική διαφορά ανάμεσα στο Πεπτίδιο 3 και την BMP-2 σε καμία από τις παραμέτρους που μελετήθηκαν είτε στον συνδυασμό τους με το Helistat®, είτε με τους σπόγγους Ζελατίνης Β 5%. Αντιθέτως, ο συνδυασμός των αυξητικών παραγόντων (25μg BMP-2 ή 150μg Πεπτιδίου 3) με τους σπόγγους Ζελατίνης Β 5% εμφάνισε σημαντικά περισσότερο νεοσχηματισμένο έκτοπο οστίτη ιστό σε σχέση με τη χρήση του Helistat® (p=0,03 και 0,04 αντίστοιχα). Επιπλέον, οι ομάδες της Ζελατίνης Β εμφάνισαν σημαντικά περισσότερα υπολειμματικά στοιχεία του υλικού, ενώ ο συνδυασμός Πεπτιδίου 3 και Ζελατίνης παρουσίασε περισσότερα στοιχεία φλεγμονής και νεοαγγείωσης. Τέλος, οι intercalated σπόγγοι, είτε έφεραν BMP-2 είτε το Πεπτίδιο 3, παρουσίασαν σημαντικά περισσότερη έκτοπη οστεοποίηση, νεοαγγείωση και παρουσία οστεοβλαστών σε σχέση με το συνδυασμό Helistat® με BMP-2. Όλες οι μεταβλητές οστεοποίησης που μπόρεσαν να επεξεργαστούν στατιστικά (νεοσχηματιζόμενο οστό, παρουσία οστεοβλαστών, οστεοκλαστών και στοιχείων οστικού μυελού) εμφάνισαν σημαντική θετική συσχέτιση με το ικρίωμα που χρησιμοποιήθηκε, τα υπολειμματικά στοιχεία του υλικού και την νεοαγγείωση. Συμπέρασμα: Τα πιλοτικά πειράματα επιβεβαίωσαν την ασφάλεια και οστεοεπαγωγικότητα του Πεπτιδίου 3, ενώ το κύριο τμήμα του πειράματος κατέδειξε τη μη κατωτερότητά του σε σχέση με ολόκληρο το μόριο της BMP-2, τουλάχιστον στις δόσεις που χρησιμοποιήθηκαν. Ειδικά ο συνδυασμός του Πεπτιδίου 3 με τους σπόγγους Ζελατίνης Β 5%, αλλά κυρίως οι intercalated σπόγγοι κατέδειξαν αξιοσημείωτη οστεοεπαγωγικότητα και οστεοκαθοδήγηση. Ευελπιστούμε το παραπάνω υλικό να αποτελέσει σημαντικό λιθαράκι στην εξέλιξη της Οστικής Μηχανικής.