Exploring oncometabolism and exosomes towards in silico, in vitro and in vivo drug repurposing in glioblastoma mutliforme

Abstract

In the era of precision oncology, clinical management of glioblastoma remains a major challenge, indicating an urgent need for novel drug targets and companion biomarkers in a multidisciplinary therapeutic strategy rationale. We and others appreciate that the elusive characterization of hypoxic and radioresistant glioblastoma cells is an important impediment to translational precision medicine. The purpose of the present study is to combine 1D and 3D data for in silico, in vitro, and in vivo drug repurposing, focusing on tumor bioenergetics and oncometabolism. The rationale of drug repurposing lies in the principles of molecular pharmacology, especially when biological redundancy and polypharmacology are considered. Both biological redundancy and polypharmacology are based on a molecular networking view of the cellular function, as they require, at first, protein-protein interactions. Putting the radioresistant cell in the spotlight, our approach is based on omics and 3D molecular structure data. We focus on disease-centric and at the same time, drug-centric repurposing of the only human paracaspase, MALT1, looking for allosteric inhibitors. We employed pharmacophore modeling and molecular docking to screen vast libraries of existing drugs and new chemical entities (NCEs), while balancing chemical diversity and drug-likeness, and next, the most promising ones were selected. Their allostery and inhibitory activity against MALT1, alongside their cytotoxicity were assessed in patient-derived glioblastoma spheroids. Drug-drug interaction risks were further explored upon CYP450-mediated inhibition profiling. Our findings allowed us to pinpoint promising candidates, exhibiting potent allosteric inhibition of MALT1 and selective cytotoxicity in MALT1-overexpressing glioblastoma spheroids. Our findings also highlight the potential of repurposing DPP-4 inhibitors, such as sitagliptin, for the treatment of glioblastoma. Additionally, exploring the interplay between MALT1 inhibition and EV-derived miRNAs, we highlight new avenues for understanding the molecular basis of glioblastoma progression and resistance. A mass spectrometry-based untargeted metabolomic analysis on plasma samples from glioblastoma patients was employed to delineate the role of metabolic remodeling in biological plasticity and, hence, disease severity. Following data processing and analysis, we established a bioenergetic profile coordinated by the mitochondrial function and redox state, lipids, and energy substrates. We propose that biological plasticity in glioblastoma is a mechanism of adaptation and resistance to treatment which is eloquently revealed by bioenergetics. As our work demonstrates, drug repurposing, guided by a comprehensive understanding of the tumor's metabolic state, holds promise for tailoring treatments to the right patient, with the right drug, at the right dose, and at the optimal time.

Στην εποχή της ογκολογίας ακριβείας, το πολύμορφο γλοιοβλάστωμα εξακολουθεί να αποτελεί έντονη πρόκληση, καλώντας προς νέους φαρμακευτικούς στόχους και συνοδούς βιοδείκτες (companion biomarkers) στo πλαίσιo μιας συνδυαστικής προσέγγισης αντιμετώπισής του. Είναι αληθές πως η εξατομικευμένη ακτινοθεραπεία δυσχεραίνεται από τον ασαφή και δίχως ομοφωνία χαρακτηρισμό του υποξικού και συνεπώς, ακτινοανθεκτικού κυττάρου. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή θα προβούμε στην επαναστόχευση φαρμάκων, in silico, in vitro και in vivo, συνδυάζοντας 1D και 3D δεδομένα, εστιάζοντας στη βιοενεργητική (bioenergetics) και τον μεταβολισμό του όγκου (oncometabolism). Η επαναστόχευση φαρμάκων θεμελιώνεται από τις αρχές της μοριακής φαρμακολογίας και συγκεκριμένα, στον βιολογικό πλεονασμό (biological redundancy) και την πολυφαρμακολογία (polypharmacology). O όρος «βιολογικός πλεονασμός» αφορά την κοινή πρωτεϊνική ρύθμιση πλήθους μονοπατιών σηματοδότησης του κυττάρου, ώστε φαινομενικά ξεχωριστές ασθένειες να οφείλονται σε κοινή παθοφυσιολογία. Ο όρος «πολυφαρμοκολογία» αναφέρεται στην ικανότητα μιας φαρμακευτικής ουσίας να δρα σε διαφορετικά μόρια-στόχους. Τόσο ο βιολογικός πλεονασμός, όσο και η πολυφαρμακολογία, αρχικά, προϋποθέτουν σχέσεις αλληλεπίδρασης μεταξύ κυτταρικών πρωτεϊνών κι επομένως, ερμηνεύονται με μια δικτυακή θεώρηση της κυτταρικής λειτουργίας. Θέτοντας το ακτινοανθεκτικό κύτταρο στο επίκεντρο του ενδιαφέροντος, η προσέγγισή μας δομείται από 1D δεδομένα ομικών τεχνολογιών και 3D δεδομένα μοριακής δομής και εστιάζει στη βιοενεργητική και τον μεταβολισμό του όγκου, αλλά και τα εξωκυττάρια κυστίδια του τελευταίου, αναζητώντας συνοδούς βιοδείκτες. Επικεντρωνόμαστε, τόσο στη νοσοκεντρική, όσο και τη φαρμακοκεντρική επαναστόχευση, με στόχο τη μοναδική ανθρώπινη παρακασπάση, MALT1, αναζητώντας αλλοστερικούς αναστολείς. Χρησιμοποιήσαμε μοντελοποίηση φαρμακοφόρων (pharmacophore modelling) και προσομοιώσεις μοριακής πρόσδεσης (molecular docking) για σάρωση βιβλιοθηκών εγκεκριμένων φαρμάκων και νέων χημικών οντοτήτων, διατηρώντας την ισορροπία ανάμεσα στη χημική ποικιλομορφία και σε ιδιότητες, που ορίζουν την ομοιότητα με φάρμακο (drug-likeness) και επιλέξαμε τις πιο υποσχόμενες ενώσεις. Η επακόλουθη πειραματική στρατηγική ήταν κρίσιμη, αξιολογώντας τη δραστικότητα των επιλεγμένων ενώσεων έναντι της MALT1, παράλληλα με την αξιολόγηση της κυτταροτοξικότητάς τους σε 3D σφαιροειδή γλοιοβλαστώματος, προερχόμενα από ασθενείς. Η αξιολόγηση του προφίλ αναστολής των κυτοχρωμάτων P450 ήταν σημαντική για την εκτίμηση του κινδύνου αλληλεπιδράσεων μεταξύ φαρμάκων για τις υποψήφιες ενώσεις. Τα ευρήματά μας οδήγησαν σε υποψήφιους αναστολείς με ισχυρή αναστολή της προτεολυτικής δράσης της MALT1 και επιλεκτική κυτταροτοξικότητα σε σφαιροειδή γλοιοβλαστώματος με υπερέκφραση αυτής. Παράλληλα, επισημαίνεται η δυνατότητα επαναστόχευσης αναστολέων της DPP-4, όπως η σιταγλιπτίνη, για τη θεραπεία του γλοιοβλαστώματος. Η διερεύνηση της συσχέτισης της αναστολής της MALT1 με miRNAs, που προέρχονται από εξωκυτταρικά κυστίδια, ανοίγει νέους δρόμους για την κατανόηση της μοριακής βάσης της εξέλιξης της νόσου και της ανθεκτικότητας στη θεραπεία. H μη στοχευμένη μεταβολομική ανάλυση βασισμένη στη φασματομετρία μάζας εφαρμόστηκε σε δείγματα πλάσματος από ασθενείς με γλοιοβλάστωμα για να αποσαφηνιστεί ο ρόλος του μεταβολικού αναπρογραμματισμού στη βιολογική πλαστικότητα του όγκου και κατά συνέπεια, στη δριμύτητα της νόσου. Μετά την επεξεργασία και ανάλυση των δεδομένων, προτείνουμε ένα βιοενεργειακό προφίλ, που χαρακτηρίζεται από τη λειτουργία των μιτοχονδρίων και την οξειδοαναγωγική κατάσταση, τα λιπίδια και τα ενεργειακά υποστρώματα. Προτείνουμε ότι η βιολογική πλαστικότητα στο γλοιοβλάστωμα είναι ένας μηχανισμός προσαρμογής και ανθεκτικότητας στη θεραπεία, που αποκαλύπτεται εύγλωττα μέσω της βιοενεργειακής κατάστασης του κυττάρου. Όπως παρουσιάζεται στην παρούσα διατριβή, η επανατοποθέτηση φαρμάκων, καθοδηγούμενη από μια ολοκληρωμένη κατανόηση της μεταβολικής κατάστασης του όγκου, μπορεί να συμβάλει σημαντικά στην εξατομίκευση της θεραπείας για τον κατάλληλο ασθενή, με το κατάλληλο φάρμακο, στη σωστή δόση και στον κατάλληλο χρόνο.