Μελέτη του ρόλου του Mcldas στις αποφάσεις διαφοροποίησης των επενδυματικών κυττάρων

Abstract

Ependymal cells are essential for maintaining the structure and function of the subventricular zone, one of the main neurogenic niches in the adult mammalian brain. These cells form rosette-like structures with neural stem cells and constitute a barrier between the cerebrospinal fluid and the underlying cellular components of the subventricular zone. Most ependymal cells have multiple motile cilia on their apical surface, thus called multiciliated or E1 ependymal cells. Multiciliated ependymal cells derive from radial glial cells that commit to this cell fate during embryogenesis, and the coordinated beating of their cilia is critical for proper cerebrospinal fluid flow. A small subpopulation of ependymal cells, typically bearing two cilia, has also been identified. These cells, known as bi-ciliated or E2 ependymal cells, remain poorly characterized, and their developmental origin and functional role have not been extensively studied. Previous studies from our lab and other research groups have shown that two members of Geminin superfamily, GemC1 and McIdas, play pivotal role in the molecular pathway governing ependymal cell generation. Specifically, GemC1 is the most upstream regulator, required for the commitment of radial glial cells to the ependymal cell fate, while the specific role of McIdas remains unclear. Here we provide evidence that McIdas has a distinct and indispensable role in ependymal cell differentiation. Our results show that McIdas deletion results in hydrocephalus development in genetically modified mice. Although radial glial cells are committed towards the ependymal cell fate, multiciliated ependymal cells are not formed in the absence of McIdas. Our findings further indicate that ependymal cell formation is blocked during the early stages of differentiation, when basal body amplification occurs. RNA sequencing analysis revealed a reduction in the expression of genes associated with multiciliogenesis, including those involved in basal body amplification, as well as in motile cilia assembly. An intriguing observation was that, unlike GemC1 knockout mice- in which we previously demonstrated a complete absence of motile cilia - in McIdas deficient mice motile cilia were detected using live microscopy. Initially, we examined the characteristics of these cilia to determine whether they exhibit characteristics of the hybrid cilium, which has recently been described as essential for the proper organization of basal bodies on the apical surface of ependymal cells and, consequently, for the optimal cellular function. Notably, McIdas deletion led to an increase in cells bearing two cilia. Through immunofluorescence and electron microscopy we examined the basal body structure and the motility patterns of cilia in these cells. Aiming to better understand the molecular mechanism governing the formation of cells with two cilia, the potential impact of Foxj1 overexpression was investigated. Foxj1 is a transcription factor that has been previously associated with the formation of cells with two cilia in Xenopus. In addition, an ex vivo culture system was employed, to reprogram astrocytes isolated from transgenic mouse models into ependymal cells, through GemC1 overexpression. Our findings suggest that the expression levels of GemC1 and McIdas are critical for maintaining the balance of ependymal cell populations. Finally, we generated transgenic mice that constitutively lack McIdas and have a brain-specific GemC1 deletion, exhibiting an anticipated loss of multiciliated ependymal cells. This system is expected to provide a powerful tool for future research. To summarize, our results establish that McIdas plays a role distinct from that of GemC1 in ependymal cell generation. Whereas GemC1 is necessary for the commitment towards the ependymal cell lineage, McIdas regulates early steps of ependymal cell differentiation. Unlike GemC1, McIdas is not required for motile ciliogenesis and hybrid cilia are formed upon its deletion. Moreover, McIdas deletion along with GemC1 overexpression may constitute the key for the balance of different ependymal cell subtypes within the subventricular zone of the brain, with potential implications for future therapeutic strategies.

Τα επενδυματικά κύτταρα αποτελούν θεμελιώδες δομικό και λειτουργικό στοιχείο της υποκοιλιακής ζώνης, μιας από τις κύριες περιοχές στον εγκέφαλο των θηλαστικών όπου δημιουργούνται νευρώνες κατά την ενήλικη ζωή. Σχηματίζουν δομές ροζέτας με τα νευρικά βλαστικά κύτταρα και αποτελούν ένα φραγμό μεταξύ του εγκεφαλονωτιαίου υγρού και των υποκείμενων κυττάρων της υποκοιλιακής ζώνης. Στην πλειοψηφία τους έχουν πολλαπλούς κινητούς κροσσούς στην κορυφαία επιφάνειά τους και για αυτό ονομάζονται πολυκροσσωτά ή Ε1 επενδυματικά κύτταρα. Προέρχονται από κύτταρα ακτινωτής γλοίας και η συντονισμένη κίνηση των κροσσών τους συμβάλει στη ροή του εγκεφαλονωτιαίου υγρού. Έχει επίσης παρατηρηθεί η ύπαρξη ενός μικρού ποσοστού επενδυματικών κυττάρων, που φέρουν συνήθως δύο κινητούς κροσσούς, και ονομάζονται δικροσσωτά ή Ε2 επενδυματικά κύτταρα, χωρίς να έχει όμως μελετηθεί η προέλευση ή ο ρόλος τους. Προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου μας αλλά και άλλων ερευνητικών ομάδων έχουν δείξει ότι τα μέλη της υπεροικογένειας της Geminin, GemC1 και McIdas, είναι μόρια-κλειδιά για τη ρύθμιση της δημιουργίας των πολυκροσσωτών κυττάρων. Πιο συγκεκριμένα, ο GemC1 αποτελεί έναν από τους πιο ανοδικούς ρυθμιστές στο μοριακό μονοπάτι που ελέγχει το σχηματισμό πολυκροσσωτών επενδυματικών κυττάρων στον εγκέφαλο, με το ρόλο του να σχετίζεται κυρίως με τον καθορισμό των κυττάρων ακτινωτής γλοίας προς την επενδυματική μοίρα. Αντίθετα, ο ρόλος που έχει ο McIdas κατά το σχηματισμό των επενδυματικών κυττάρων δεν έχει αποσαφηνιστεί. Στα πλαίσια της συγκεκριμένης εργασίας προέκυψαν αποτελέσματα όπου ανέδειξαν τον διακριτό ρόλο που έχει ο McIdas κατά τη δημιουργία των επενδυματικών κυττάρων. Πιο συγκεκριμένα, τα πειράματά μας έδειξαν ότι η απαλοιφή του McIdas προκαλεί φαινότυπο υδροκεφαλίας στους διαγονιδιακά τροποποιημένους μυς. Επιπλέον παρατηρήθηκε ότι παρότι τα κύτταρα ακτινωτής γλοίας καθορίζονται προς την επενδυματική μοίρα, δεν σχηματίζονται πολυκροσσωτά επενδυματικά κύτταρα απουσία του McIdas. Δείξαμε ότι η δημιουργία τους παρεμποδίζεται κατά τα αρχικά στάδια της διαφοροποίησης, όπου κανονικά θα πραγματοποιούταν ο πολλαπλασιασμός των βασικών σωματίων. Παράλληλα, μέσω πειραμάτων αλληλούχισης RNA, είδαμε ότι μειώνεται η έκφραση γονιδίων που έχουν συνδεθεί με τη δημιουργία των πολυκροσσωτών κυττάρων. Συγκεκριμένα, παρατηρήσαμε μείωση της έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό των βασικών σωματίων καθώς και γονιδίων που εμπλέκονται στη σύνθεση των κινητών κροσσών. Μια ενδιαφέρουσα παρατήρηση ήταν ότι σε αντίθεση με τους GemC1 ελλειμματικούς μυς, στους οποίους σύμφωνα με προηγούμενα δεδομένα του εργαστηρίου μας δε σχηματίζονται καθόλου κινητοί κροσσοί, στους μυς με απαλοιφή του McIdas εντοπίστηκαν μέσω live μικροσκοπίας κινητοί κροσσοί. Αρχικά εξετάσαμε αυτούς τους κροσσούς και διερευνήσαμε εάν φέρουν χαρακτηριστικά του υβριδικού κροσσού, όπου έχει δειχτεί σε πρόσφατη δημοσίευση ότι είναι θεμελιώδης για τη σωστή διευθέτηση των βασικών σωματίων στην κορυφαία επιφάνεια των επενδυματικών κυττάρων και κατ’ επέκταση τη σωστή λειτουργία των επενδυματικών κυττάρων. Παράλληλα, απουσία του McIdas εντοπίστηκε αύξηση του αριθμού των κυττάρων με δύο κροσσούς. Μέσω ανοσοφθορισμού και ηλεκτρονικής μικροσκοπίας εξετάσαμε τα χαρακτηριστικά των βασικών σωματίων των κυττάρων με τους δύο κροσσούς και διερευνήσαμε το μοτίβο κινητικότητας των κροσσών που φέρουν. Με στόχο την κατανόηση του μοριακού μηχανισμού που διέπει τη δημιουργία των κυττάρων με δύο κροσσούς, εξετάσαμε την πιθανή επίδραση της υπερέκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Foxj1, καθώς σε προηγούμενες μελέτες τα επίπεδα έκφρασής του στο Xenopus έχουν συσχετιστεί με το σχηματισμό κυττάρων με δύο κροσσούς. Ακόμη χρησιμοποιήσαμε ένα ex vivo σύστημα καλλιέργειας αστροκυττάρων απομονωμένων από διαγονιδιακά τροποποιημένους μυς, το οποίο έχει χρησιμοποιηθεί στο παρελθόν για επαναπρογραμματισμό τους προς επενδυματικά κύτταρα, μέσω της υπερέκφρασης του GemC1. Τα ευρήματά μας υπέδειξαν τη σημασία των επιπέδων έκφρασης των παραγόντων GemC1 και McIdas για την ισορροπία των πληθυσμών των επενδυματικών κυττάρων. Τέλος, δημιουργήθηκαν διαγονιδιακά τροποποιημένοι μυς οι οποίοι έχουν ολική απαλοιφή του McIdas και ιστοειδική απαλοιφή στον εγκέφαλο για τον GemC1, όπου παρατηρήθηκε η αναμενόμενη απώλεια των πολυκροσσωτών επενδυματικών κυττάρων. Το σύστημα αυτό θα αποτελέσει πολύτιμο εργαλείο για μελλοντικές μελέτες. Συνοψίζοντας, τα αποτελέσματα που προέκυψαν στη συγκεκριμένη εργασία υποδεικνύουν ότι ο McIdas έχει διακριτό ρόλο από τον GemC1 κατά τη δημιουργία των επενδυματικών κυττάρων. Ενώ ο GemC1 ρυθμίζει τον καθορισμό προς την επενδυματική μοίρα, ο McIdas εμπλέκεται στα αρχικά στάδια της διαφοροποίησης των επενδυματικών κυττάρων. Σε αντίθεση με τον GemC1, η παρουσία του McIdas δεν κρίνεται απαραίτητη για τη σύνθεση κινητών κροσσών, δεδομένου ότι ο σχηματισμός του υβριδικού κροσσού δεν φαίνεται να εξαρτάται από αυτόν. Τέλος, η απαλοιφή του McIdas σε συνδυασμό με την έκφραση του GemC1 ενδέχεται να είναι το πιθανό κλειδί για τη δημιουργία των διαφορετικών τύπων επενδυματικών κυττάρων στην υποκοιλιακή ζώνη του εγκεφάλου, γεγονός που μπορεί να αξιοποιηθεί για θεραπευτικούς σκοπούς στο μέλλον.