Study of intracellular pathogenic bacteria in human cells

Abstract

Legionella pneumophila is the causative agent of Legionnaires' Disease (LD), an atypical pneumonia which can become fatal if not properly diagnosed and treated. L. pneumopila primarily infects alveolar macrophages upon inhalation of contaminated aerosols. Neutrophils, as the first line of defense, infiltrate the lungs during L. pneumophila infection. However, despite their importance against bacterial infection, their involvement in the immune responses in LD remain unclear. Additionally, a severe complication of LD, which is linked to worse prognosis, is multi organ failure. IL-1β is a crucial orchestrator of the cytokine storm which can lead to multi organ failure associated with sepsis. Cat scratch disease (CSD) is the most common clinical manifestation of Bartonella henselae infection and is considered one of the most frequent bacterial etiological agents of benign lymphadenopathy in the young population worldwide. In immunocompetent patients it usually presents as a mild but often long-lasting swelling of the lymph nodes. However, there is very limited information and understanding on the immune responses that occur during a B. henselae infection or how lymphadenitis is orchestrated. Innate immune system is usually the main sentinel against bacterial infections, however, very little is known about the implication of innate cells in CSD, despite the fact that CSD granulomas are neutrophil rich. The interaction of neutrophils with L. pneumophila and B. henselae was assessed in vitro. Neutrophils from healthy individuals were infected with opsonized and non-opsonized bacteria. Phagocytosis was determined by immunolabeling, and Reactive Oxygen Species (ROS) by flow cytometry. The ability of neutrophils to form Neutrophil Extracellular Traps (NETs) in response to L. pneumophila and B. henselae and the impact of these NETs on bacterial proliferation were examined. Immunolabeling and Western blotting was used for specific NET-associated epitope detection. In addition, lymph node biopsies were immunostained to investigate the neutrophilic involvement in the lymph node enlargement. Regarding L. pneumophila, control neutrophils were infected in vitro and it was revealed that opsonized bacteria were phagocytosed, in contrast to non-opsonized bacteria which were not phagocytosed. Moreover, opsonized bacteria triggered ROS production, unlike non-opsonized bacteria. Furthermore, neutrophils released NETs upon L. pneumophila interaction, and this NET release was ROS independent, since ROS inhibition did not affect NETosis. Moreover, NETs failed to inhibit bacterial proliferation. Notably, IL-1β was also detected on NETs induced by L. pneumophila. In the case B. henselae, purified neutrophils were infected in vitro with opsonized and non opsonized bacteria, and it was found that phagocytosis is significantly enhanced after opsonization. Additionally, neutrophils infected with opsonized B. henselae produced significantly more ROS than infection with non opsonized bacteria. Moreover, B. henselae induced NET release in neutrophils in vitro. Finally, CSD lymph node biopsy specimens were found to have excessive neutrophil infiltration and significant NETosis. These findings contribute to the understanding of neutrophil-mediated immune responses in LD and could shed light on the pathophysiology of multi organ failure. Additionally, in CSD, neutrophils and NETs are strongly associated with enlarged lymph nodes which could play an important role in the orchestration of the long lasting lymphadenopathy.

Η Legionella pneumophila είναι ο αιτιολογικός παράγοντας της Νόσου των Λεγεωνάριων (Legionnaires' Disease, LD), μιας άτυπης μορφής πνευμονίας που μπορεί να αποβεί θανατηφόρα εάν δεν διαγνωστεί και αντιμετωπιστεί έγκαιρα. Η L. pneumophila προσβάλλει κυρίως τα κυψελιδικά μακροφάγα μετά από εισπνοή μολυσμένων αερολυμάτων. Τα ουδετερόφιλα, ως η πρώτη γραμμή άμυνας, διεισδύουν στους πνεύμονες κατά τη διάρκεια της λοίμωξης από L. pneumophila. Ωστόσο, παρά τη σημασία τους έναντι των βακτηριακών λοιμώξεων, η συμμετοχή τους στις ανοσολογικές αποκρίσεις κατά τη νόσο των Λεγεωνάριων παραμένει ασαφής. Επιπλέον, μια σοβαρή επιπλοκή της LD, η οποία συνδέεται με δυσμενή πρόγνωση, είναι η πολυοργανική ανεπάρκεια. Η IL-1β αποτελεί κρίσιμο ρυθμιστή της καταιγίδας κυτταροκινών, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε πολυοργανική ανεπάρκεια που σχετίζεται με σήψη. Η νόσος εξ ονύχων γαλής (Cat Scratch Disease, CSD) είναι η συχνότερη κλινική εκδήλωση της λοίμωξης από Bartonella henselae και θεωρείται μία από τις πιο κοινές βακτηριακές αιτίες καλοήθους λεμφαδενοπάθειας στον νεανικό πληθυσμό παγκοσμίως. Σε ανοσοεπαρκείς ασθενείς, συνήθως εκδηλώνεται ως ήπια αλλά συχνά παρατεταμένη διόγκωση των λεμφαδένων. Ωστόσο, υπάρχουν περιορισμένες πληροφορίες και κατανόηση σχετικά με τις ανοσολογικές αποκρίσεις που λαμβάνουν χώρα κατά τη λοίμωξη από B. henselae, καθώς και για τον τρόπο με τον οποίο οργανώνεται η λεμφαδενίτιδα. Το έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα αποτελεί συνήθως τον κύριο φρουρό έναντι των βακτηριακών λοιμώξεων, όμως ελάχιστα είναι γνωστά για τη συμμετοχή των έμφυτων κυττάρων στη CSD, παρά το γεγονός ότι τα κοκκιώματα της νόσου εξ ονύχων γαλής είναι πλούσια σε ουδετερόφιλα.Η αλληλεπίδραση των ουδετεροφίλων με τη L. pneumophila και τη B. henselae μελετήθηκε in vitro. Τα ουδετερόφιλα από υγιή άτομα μολύνθηκαν με οψωνοποιημένα και μη οψωνοποιημένα βακτήρια. Η φαγοκυττάρωση προσδιορίστηκε με ανοσοσήμανση, ενώ οι δραστικές ρίζες οξυγόνου (ROS) με κυτταρομετρία ροής. Διερευνήθηκε η ικανότητα των ουδετεροφίλων να σχηματίζουν εξωκυττάριες ουδετεροφιλικές παγίδες (Neutrophil Extracellular Traps, NETs) ως απόκριση στις L. pneumophila και B. henselae, καθώς και η επίδραση των NETs στον πολλαπλασιασμό των βακτηρίων.Η ανοσοσήμανση και το Western blotting χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση ειδικών επιτόπων πάνω στα NETs. Επιπλέον, βιοψίες λεμφαδένων ανοσοχρωματίστηκαν για να διερευνηθεί η συμμετοχή των ουδετεροφίλων στη διόγκωση τους. Όσον αφορά στη L. pneumophila, τα υγιή ουδετερόφιλα μολύνθηκαν in vitro και διαπιστώθηκε ότι τα οψωνοποιημένα βακτήρια υφίστανται φαγοκυττάρωση, σε αντίθεση με τα μη οψωνοποιημένα, τα οποία δεν φαγοκυττώνονται. Επιπλέον, τα οψωνοποιημένα βακτήρια προκάλεσαν παραγωγή ROS, ενώ τα μη οψωνοποιημένα όχι. Παράλληλα, τα ουδετερόφιλα απελευθέρωσαν NETs μετά από αλληλεπίδραση με L. pneumophila, και η απελευθέρωση αυτή ήταν ανεξάρτητη των ROS, καθώς η αναστολή των ROS δεν επηρέασε την παραγωγή τους (NETosis). Ωστόσο, τα NETs δεν ανέστειλαν τον πολλαπλασιασμό των βακτηρίων. Αξιοσημείωτο είναι ότι η IL-1β ανιχνεύθηκε επίσης πάνω στα NETs που προκλήθηκαν από L. pneumophila. Στην περίπτωση της B. henselae, ουδετερόφιλα μολύνθηκαν in vitro με οψωνοποιημένα και μη οψωνοποιημένα βακτήρια, και διαπιστώθηκε ότι η φαγοκυττάρωση αυξήθηκε σημαντικά μετά την οψωνοποίηση. Επιπλέον, τα ουδετερόφιλα που μολύνθηκαν με οψωνοποιημένη B. henselae παρήγαγαν σημαντικά περισσότερα ROS σε σύγκριση με εκείνα που μολύνθηκαν με μη οψωνοποιημένα βακτήρια. Επιπλέον, η B. henselae προκάλεσε απελευθέρωση NETs από ουδετερόφιλα in vitro. Τέλος, τα δείγματα βιοψίας λεμφαδένων από ασθενείς με νόσο εξ ονύχων γαλής παρουσίασαν εκτεταμένη διήθηση ουδετεροφίλων και σημαντική απελευθέρωση NETs (NETosis).Τα παραπάνω ευρήματα συμβάλλουν στην κατανόηση των ουδετεροφιλικά μεσολαβούμενων ανοσολογικών αποκρίσεων στη νόσο των Λεγεωνάριων και ενδέχεται να ρίξουν φως στην παθοφυσιολογία της πολυοργανικής ανεπάρκειας. Επιπλέον, στη νόσο εξ ονύχων γαλής, τα ουδετερόφιλα και τα NETs συνδέονται στενά με τη διόγκωση των λεμφαδένων, γεγονός που ενδέχεται να διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην οργάνωση της μακροχρόνιας λεμφαδενοπάθειας.