Ανάπτυξη καινοτόμων φαρμακομορφών για τη βελτιωμένη χορήγηση φλαβονοειδών

Abstract

In the present doctoral dissertation, the development of innovative pharmaceutical formulations for the improved administration of flavonoids was studied. Luteolin was selected as the active pharmaceutical ingredient, as a major representative of the class due to its multifaceted bioactivity and physicochemical properties. Luteolin exhibits low aqueous solubility and reduced bioavailability, similar to most flavonoids, presenting significant challenges during its formulation. In this context, the techniques of “Amorphous Solid Dispersions (ASD)” and “Deep Eutectic Solvents (DESs)” were employed as modern formulation methods to increase the solubility of luteolin (LUT), in order to produce final effective dosage forms. Furthermore, its administration within the oral cavity (buccal or topical) was investigated as a proposed approach, by developing and evaluating gel systems. In the first part of the research, after the thermophysical characterization of the active substance, solid dispersions (SDs) of luteolin were prepared using semicrystalline and amorphous polymeric carriers. Polyethylene glycol (PEG) and Poloxamer 188 (P188) were initially selected, with melt and solvent evaporation techniques used for the preparation of the SDs. The use of differential scanning calorimetry (DSC) and scanning electron microscopy (SEM) indicated the amorphization of the active substance within the SDs, a finding that was also confirmed by powder X-ray diffraction (pXRD) patterns. Additionally, attenuated total reflectance Fourier-transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) showed the existence of molecular interactions between the active substance and the polymeric carrier. Finally, the in vitro drug release profile study in simulated saliva fluid (SSF) demonstrated that these systems provided higher solubility levels compared to crystalline luteolin. Subsequently, regarding the formulation using amorphous polymeric carriers, the appropriate carrier was initially selected (screening) using two different methods (“film casting” and “solvent shift”), in order to inhibit recrystallization of the active substance and prevent its precipitation in the dissolution medium. Polyvinylpyrrolidone (PVP) emerged as the optimal carrier, being fully miscible with the active substance. Afterwards, the complete amorphization of LUT within the LUT-PVP SDs, as well as the stability of the systems for three months, was demonstrated via pXRD. Concurrently, molecular dynamics (MD) simulations and the use of ATR-FTIR spectroscopy proved the presence of strong intermolecular hydrogen bonds between luteolin and PVP, which stabilize the final systems. In vitro dissolution studies in simulated saliva fluid (SSF) confirmed the enhancement of solubility through ASDs, reaching up to six times higher levels compared to the crystalline drug. In the second part of the thesis, the evaluation of DES pharmaceutical formulations was attempted. Specifically, after the preparation of various systems, using choline chloride (ChCl) as a hydrogen bond acceptor (HBA) and examining different components as hydrogen bond donors (HBD), the stable DESs were subjected to solubility tests. The latter proved that all examined systems significantly increased the solubility of luteolin, with the greatest enhancement observed in glycerol (Gly)-based systems, particularly in those with molar ratios of ChCl:Gly (1:2) (DESA) and ChCl:Gly (1:3) (DESB). The thermal stability of these systems up to approximately 150°C was demonstrated through thermogravimetric analysis (TGA), confirming their suitability for thermal processing (such as tablet or capsule formation using wet granulation). Finally, ATR-FTIR spectroscopy and especially molecular modeling studies proved the presence of strong molecular interactions both among the individual components of the DES and with LUT. In the final part of the dissertation, a comparative study of ASDs (incorporated into a suitable gel system) and DES systems was conducted. In vitro drug release profile tests, using vertical Franz diffusion cells, showed enhanced solubility of the active substance in nearly all cases. Simultaneously, the suitability of these systems for intraoral administration was demonstrated, as they exhibit pseudoplastic flow behavior. Additionally, in vitro cell viability and anti-inflammatory activity studies on a gingival cell line confirmed the absence of cytotoxicity for all systems and the preservation of luteolin’s pharmacological activity. In fact, in the case of DES, an enhancement of the anti-inflammatory activity was observed, attributed to the presence of choline chloride in the systems. Finally, ex vivo permeability studies on porcine buccal tissue demonstrated a significant increase in luteolin retention within the tissue. In conclusion, the present doctoral dissertation highlighted the potential of modern formulation techniques (such as ASDs and DESs) to substantially enhance the solubility of luteolin, thereby contributing to the improved pharmaceutical exploitation of flavonoids. The final dosage forms developed exhibited stability, improved in vitro performance, and suitability for oral administration (buccal or topical), thanks to their favorable rheological and pharmaceutical properties. Particular emphasis should be placed on the DES systems, where the presence of choline chloride appears to contribute significantly not only in enhancing the solubility of the active substance but also in enhancing its anti-inflammatory activity through a synergistic mechanism. However, further in vivo studies are required for the comprehensive evaluation of the safety, bioavailability, and therapeutic efficacy of the proposed pharmaceutical formulations.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η ανάπτυξη καινοτόμων φαρμακομορφών για τη βελτιωμένη χορήγηση φλαβονοειδών. Ως δραστικό φαρμακολογικό συστατικό επιλέχθηκε η λουτεολίνη, κύριος εκπρόσωπος της κατηγορίας λόγω της πολύπλευρης βιοδραστικότητάς της και των φυσικοχημικών της χαρακτηριστικών. Η ίδια παρουσιάζει χαμηλή υδατοδιαλυτότητα και μειωμένη βιοδιαθεσιμότητα, όπως η πλειοψηφία των φλαβονοειδών, εμφανίζοντας μείζονα ζητήματα κατά τη μορφοποίησή της. Στο πλαίσιο αυτό, αξιοποιήθηκαν οι τεχνικές των «Άμορφων Στερεών Διασπορών (ΑΣΔ)» και των «Βαθέως Ευτηκτικών Διαλυτών (DES)» ως σύγχρονες μέθοδοι μορφοποίησης με στόχο την αύξηση της διαλυτότητας της λουτεολίνης (LUT), ώστε να παραχθούν τελικές αποτελεσματικές φαρμακομορφές. Ακόμη, διερευνήθηκε ως προτεινόμενη προσέγγιση η χορήγησή της εντός της στοματικής κοιλότητας (παρειακή ή τοπική) με την ανάπτυξη και αξιολόγηση συστημάτων γέλης. Στο πρώτο μέρος της έρευνας, έπειτα από τον θερμοφυσικό χαρακτηρισμό της δραστικής ουσίας, προετοιμάστηκαν στερεές διασπορές (ΣΔ) λουτεολίνης με χρήση ημικρυσταλλικών και άμορφων πολυμερικών φορέων. Αρχικά, επιλέχθηκαν η πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) και το πολοξαμερές 188 (P188) και ως μέθοδοι παρασκευής αυτές της τήξης και της εξάτμισης διαλύτη για την προετοιμασία των ΣΔ. Η χρήση διαφορικής θερμιδομετρίας σάρωσης (DSC) και ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης (SEM) υπέδειξαν την αμορφοποίηση της δραστικής ουσίας εντός των ΣΔ, δεδομένο που επιβεβαιώθηκε και από τα διαγράμματα της περίθλασης ακτινών Χ κόνεως (pXRD). Επιπλέον, η ανάλυση μέσω της φασματοφωτομετρίας υπέρυθρου με αποσβένουσα ολική ανάκληση (ATR-FTIR) παρουσίασε την ύπαρξη μοριακών αλληλεπιδράσεων μεταξύ δραστικής ουσίας και πολυμερικού φορέα. Τέλος, η in vitro μελέτη του προφίλ αποδέσμευσης φαρμάκου σε υγρό προσομοίωσης σιέλου (SSF) απέδειξε ότι τα συστήματα αυτά αποδίδουν υψηλότερα επίπεδα διαλυτότητας, σε σύγκριση με την κρυσταλλική λουτεολίνη. Στη συνέχεια, όσον αφορά τη μορφοποίηση με άμορφους πολυμερικούς φορείς, πραγματοποιήθηκε αρχικά η επιλογή του κατάλληλου φορέα (screening) μέσω δύο διαφορετικών μεθόδων (“film casting” και “solvent shift”) με σκοπό την αναστολή της ανακρυστάλλωσης της δραστικής ουσίας και την παρεμπόδιση της κατακρήμνισής της στο υγρό μέσο διάλυσης. Ως βέλτιστος φορέας προέκυψε η πολυβινυλοπυρρολιδόνη (PVP), η οποία ήταν πλήρως αναμίξιμη με τη δραστική ουσία. Έπειτα, η πλήρης αμορφοποίηση της LUT εντός των ΣΔ LUT-PVP, καθώς και η σταθερότητα των συστημάτων για τρεις μήνες αποδείχθηκε μέσω pXRD. Συγχρόνως, μελέτες προσομοίωσης μοριακής δυναμικής (MD) και η χρήση φασματοσκοπίας ATR-FTIR απέδειξαν την παρουσία ισχυρών διαμοριακών δεσμών υδρογόνου μεταξύ της λουτεολίνης και της PVP, γεγονός που σταθεροποιεί τα τελικά συστήματα. Οι in vitro δοκιμές διάλυσης της σε υγρό προσομοίωσης σιέλου (SSF) επιβεβαίωσαν τη βελτίωση της διαλυτότητας της μέσω των ΑΣΔ, έως και έξι φορές περισσότερο σε σύγκριση με την αντίστοιχη του κρυσταλλικού φαρμάκου. Tο δεύτερο τμήμα της διατριβής πραγματεύεται την αξιολόγηση φαρμακευτικών μορφών DES. Ειδικότερα, έπειτα από την προετοιμασία διάφορων συστημάτων, χρησιμοποιώντας ως δέκτη δεσμών υδρογόνου (HBA) την χλωριούχο χολίνη (ChCl) και εξετάζοντας διαφορετικά συστατικά ως δότες δεσμών υδρογόνου (HBD), τα σταθερά DES υποβλήθηκαν σε δοκιμές διαλυτότητας. Οι τελευταίες απέδειξαν ότι όλα τα εξεταζόμενα συστήματα αύξησαν τη διαλυτότητα της λουτεολίνης σε σημαντικό βαθμό, με την πιο έντονη ενίσχυση να προκύπτει από την γλυκερόλη (Gly) ως HBD και συγκεκριμένα στα συστήματα με τις μοριακές αναλογίες ChCl:Gly (1:2) (DESA) και ChCl:Gly (1:3) (DESΒ). Η θερμική σταθερότητα των συστημάτων αυτών μέχρι περίπου τους 150°C αποδείχθηκε μέσω θερμοσταθμικής ανάλυσης (TGA), επιβεβαιώνοντας την καταλληλότητα τους για θερμικές διεργασίες (όπως η δημιουργία δισκίων ή καψακίων με τη χρήση υγρής κοκκοποίησης). Τέλος, η φασματοφωτομετρία ATR-FTIR και ιδιαιτέρως οι μελέτες μοριακής προσομοίωσης απέδειξαν την ύπαρξη ισχυρών μοριακών αλληλεπιδράσεων τόσο μεταξύ των επιμέρους συστατικών του DES όσο και με την LUT. Στο τελευταίο μέρος της διδακτορικής διατριβής, επιχειρείται η συγκριτική μελέτη των ΑΣΔ (με την ενσωμάτωση τους σε ένα κατάλληλο σύστημα γέλης) και των συστημάτων DES. Οι δοκιμές του in vitro προφίλ αποδέσμευσης του φαρμάκου, με τη χρήση κάθετων κελιών διάχυσης Franz, έδειξαν την ενίσχυση της διαλυτότητας της φαρμακευτικής ουσίας σχεδόν σε όλες τις περιπτώσεις. Ταυτόχρονα, αποδείχθηκε η καταλληλότητα των συστημάτων αυτών για χορήγηση εντός της στοματικής κοιλότητας, καθώς εμφανίζουν ψευδοπλαστική συμπεριφορά ροής. Επιπρόσθετα, in vitro μελέτες κυτταρικής βιωσιμότητας και αντιφλεγμονώδους δράσης σε κυτταρική σειρά ούλων επιβεβαίωσαν την απουσία κυτταροτοξικότητας για όλα τα συστήματα και τη διατήρηση της φαρμακολογικής ιδιότητας της λουτεολίνης. Μάλιστα, στην περίπτωση των DES, παρατηρήθηκε βελτίωση της αντιφλεγμονώδους δράσης, λόγω της παρουσίας χλωριούχου χολίνης στα συστήματα. Τέλος, οι ex vivo μελέτες διαπερατότητας σε παρειακό ιστό χοίρου απέδειξαν τη σημαντική ενίσχυση της συγκράτησης της λουτεολίνης εντός του ιστού. Συμπερασματικά, η παρούσα διδακτορική διατριβή ανέδειξε τη δυνατότητα των σύγχρονων τεχνικών μορφοποίησης (όπως οι ΑΣΔ και οι DESs) να ενισχύουν ουσιαστικά τη διαλυτότητα της λουτεολίνης, συμβάλλοντας κατ’ επέκταση στην καλύτερη φαρμακοτεχνική αξιοποίηση των φλαβονοειδών. Οι τελικές φαρμακομορφές που αναπτύχθηκαν επιδεικνύουν σταθερότητα, βελτιωμένη απόδοση in vitro και καταλληλότητα για στοματική χορήγηση (παρειακή ή τοπική), χάρις στις ευνοϊκές ρεολογικές και φαρμακοτεχνικές τους ιδιότητες. Ιδιαίτερη έμφαση πρέπει να δοθεί στα συστήματα DES, όπου η παρουσία της χλωριούχου χολίνης φαίνεται να συμβάλλει καθοριστικά όχι μόνο στην αύξηση της διαλυτότητας της δραστικής ουσίας, αλλά και στην ενίσχυση της αντιφλεγμονώδους δράσης της μέσω ενός συνεργιστικού μηχανισμού. Ωστόσο, περαιτέρω in vivo μελέτες απαιτούνται για την πλήρη αξιολόγηση της ασφάλειας, της βιοδιαθεσιμότητας και της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας των προτεινόμενων φαρμακομορφών.