Έκφραση, απομόνωση, φυσικοχημικός χαρακτηρισμός και μελέτη της σχέσης δομής - λειτουργίας ανασυνδυασμένων πολυπεπτιδίων του αντιγραφικού συμπλέγματος του ιου της Ηπατίτιδας Ε (HEV1)

Abstract

RNA viruses have been one of the most significant threats to public health. The Hepatitis E virus (Hepatitis E Virus, HEV), an RNA virus with worldwide distribution, is recognized as the dominant causative agent of viral hepatitis, with an estimated 20 million infections annually. Despite its significant epidemiological importance, it remains under-studied at molecular level, while the absence of targeted therapeutic interventions or a globally approved vaccine highlights the need for an in-depth understanding of the virus’s biology. The HEV replication complex (ORF1) is a critical factor for avoiding immune recognition and for the effective reproduction of the virus. It consists of distinct functional domains involved in various cellular pathways notably, ADP-ribosylation, ubiquitination, and methylation of viral RNA. Within the scope of this doctoral dissertation, three key protein domains of ORF1 were studied: the macro domain (MD), the methyltransferase (MeT), and the putative cysteine protease (PCP). Overall, the work focuses on the structural and functional elucidation of the aforementioned ORF1 domains. The macro domain was isolated in high purity in solution, and its structure was determined through NMR spectroscopy, both in its free form and in complex with its ligand ADPr. Further binding studies with ADPr derivatives combined with targeted mutagenesis identified critical amino acid residues responsible for binding specificity. Its activity as both a de-MAR and de-PAR enzyme was determined for the first time through functional assays. The MeT domain, responsible for the formation of Cap0 structures on newly synthesized viral RNA, was delineated within ORF1 and characterized physicochemically and functionally. Its intra-domain interaction with the MD was also examined, revealing potential regulatory/cooperative functions of the individual viral domains. Finally, the PCP was studied physicochemically, and its involvement in the ubiquitination pathway through inhibitory action on host target proteins was investigated. Characterization of these domains using techniques from molecular and cellular biology, biochemistry, protein chemistry, and biophysical analyses provided valuable information on their spatial arrangement, the interactions they perform, and the resulting biological effect. These findings lay the scientific foundation for clarifying the virus’s biology, which may lead to the design of selective bioactive ligand molecules, ultimately aiming at the development of targeted antiviral strategies against HEV.

Οι RNA ιοί αποτελούν διαχρονικά μία από τις σημαντικότερες απειλές για τη δημόσια υγεία. Ο ιός της ηπατίτιδας Ε (Hepatitis E Virus, HEV), RNA ιός με παγκόσμια εξάπλωση, αναγνωρίζεται ως ο κυρίαρχος αιτιολογικός παράγοντας ιογενούς ηπατίτιδας, με εκτιμώμενες 20 εκατομμύρια λοιμώξεις ετησίως. Παρά τη βαρύνουσα επιδημιολογική του σημασία, παραμένει υπομελετημένος σε μοριακό επίπεδο, ενώ η απουσία στοχευμένων θεραπευτικών παρεμβάσεων ή εγκεκριμένου εμβολίου παγκόσμιας διάθεσης καταδεικνύει την ανάγκη για εις βάθος κατανόηση της βιολογίας του ιού. Το αντιγραφικό σύμπλεγμα του HEV (ORF1) αποτελεί κρίσιμο παράγοντα για την αποφυγή της ανοσολογικής αναγνώρισης και την αποτελεσματική αναπαραγωγή του ιού. Απαρτίζεται από διακριτούς λειτουργικούς τομείς που εμπλέκονται σε ποικίλα κυτταρικά μονοπάτια με ενδεικτικά, την ADP-ριβοζυλίωση, την ουβικιτινίωση και τη μεθυλίωση του RNA. Στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής, μελετήθηκαν τρεις κομβικές πρωτεϊνικές επικράτειες του ORF1: η macro επικράτεια (MD), η μεθυλομεταφοράση (MeT) και η πρωτεάση (PCP). Συνολικά, η εργασία επικεντρώνεται στη δομική και λειτουργική αποσαφήνιση των προαναφερθέντων τομέων του ORF1. Η macro επικράτεια απομονώθηκε σε υψηλή καθαρότητα και η δομή της προσδιορίστηκε μέσω φασματοσκοπίας NMR, σε ελεύθερη μορφή αλλά και σε σύμπλοκο με τον φυσικό προσδέτη ADPr. Περαιτέρω μελέτες πρόσδεσης με παράγωγα του ADPr σε συνδυασμό με κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση, κατέδειξαν κρίσιμα αμινοξικά κατάλοιπα, υπεύθυνα για την εξειδίκευση της πρόσδεσης. Επιπλέον, η δραση της ως MAR αλλά και PAR υδρολάσης προσδιορίστηκε για πρώτη φορά μέσω λειτουργικών δοκιμασιών. Η επικράτεια της MeT, υπεύθυνη για τον σχηματισμό Cap0 δομών στα νεοσυντιθέμενα ιικά RNA, οριοθετήθηκε εντός του ORF1 και χαρακτηρίστηκε φυσικοχημικά και λειτουργικά. Επίσης, εξετάστηκε η ενδοειδική της αλληλεπίδραση με την MD, αναδεικνύοντας ρυθμιστικές/συνεργατικές λειτουργίες των επιμέρους επικρατειών. Tέλος η επικράτεια PCP, μελετήθηκε φυσικοχημικά και διερευνήθηκε η εμπλοκή της στο μονοπάτι της ουβικιτινίωσης μέσω ανασταλτικής δράσης επί πρωτεϊνών-στόχων του ξενιστή. Ο χαρακτηρισμός των τομέων μέσω τεχνικών μοριακής και κυτταρικής βιολογίας, βιοχημείας, πρωτεϊνικής χημείας και βιοφυσικών αναλύσεων παρείχε πολύτιμες πληροφορίες για την διαμόρφωση τους στο χώρο, των αλληλεπιδράσεων που επιτελούν καθώς και του βιολογικού αποτελέσματος που ακολουθεί. Τα ευρήματα αυτά θέτουν τα επιστημονικά θεμέλια για την αποσαφήνιση της βιολογίας του ιού, η οποία δύναται να οδηγήσει στον σχεδιασμό εκλεκτικών βιοδραστικών μορίων-προσδετών, με απώτερο στόχο την ανάπτυξη στοχευμένων αντιικών στρατηγικών έναντι του HEV.