Μελέτη της συνδυαστικής επίδρασης του rTMS με αντιεπιληπτικά φάρμακα σε μοντέλο επιληψίας στην κυτταρική σειρά SH-SY5Y

Abstract

Epilepsy as a disease affects over 68 million people worldwide and may have genetic or acquired causes. Antiepileptic drugs are used to manage and treat this disease. They display a variety of mechanisms of action by reducing the firing of neurons, acting either on ion channels involved in the generation of action potentials or by regulating synaptic transmission through receptors. Despite the increasing number of antiepileptic drugs available, about three out of ten epileptic patients suffer from the disease. Drug-resistant epilepsy (DRE) is specified as the persistence of seizures despite the administration of at least two suitable anticonvulsants in an effective daily dose. Repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) is a non-invasive method of stimulating the cerebral cortex that may affect synaptic plasticity and produce persistent effects in the brain. The purpose of this thesis is to elucidate the combined effect of antiepileptic drugs with the rTMS method in vitro, in the human derived SH-SY5Y neuroblastoma cell line. The experiment involves an in vitro model of epilepsy in the differentiated SH-SY5Y cell line, where intracellular calcium level alterations were investigated using the calcium-sensitive fluorescent marker fluo-4, AM. The cell line differentiation protocol to a more mature neuronal phenotype was performed using retinoic acid (RA) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF). Neuronal stimulation was achieved by the addition of potassium chloride. Two experimental procedures were performed, one based on the antiepileptic drug diazepam and one based on the antiepileptic drug lacosamide. Cell cultures were studied under the influence of either low-frequency (1Hz) rTMS, diazepam or lacosamide, or their combination. Between those different conditions, statistical analysis was performed to evaluate the mean fluorescence differences of the studied cell cultures using the non-parametric Kruskal–Wallis test. In the diazepam experiment, when the drug and rTMS were used concomitantly, they showed the greatest reduction in intracellular calcium levels, compared to the control cell cultures, while also when each one of them was used individually an inferior but strong effect was observed. Accordingly, the combination of lacosamide and low frequency rTMS also appeared to have the highest efficacy, showing the lowest intracellular calcium increase, followed by lacosamide when used exclusively and finally by rTMS without any pharmacological intervention. Both diazepam and low-frequency rTMS appear to have the ability to control seizure activity in vitro, while their combination appears to be the most effective. Lacosamide and low-frequency rTMS appeared to be able to control evoked seizure activity. Their combination appears to have the highest efficacy over pharmacological intervention or magnetic stimulation, when used individually. This combined use between antiepileptic drugs and rTMS could be particularly useful in patients with drug-resistant epilepsy in order to manage their disease more effectively. These results demonstrate the need for new preclinical or clinical studies.

Η επιληψία είναι μια ασθένεια που επηρεάζει πάνω από 68 εκατομμύρια ανθρώπους σε όλο τον κόσμο, ενώ μπορεί να έχει γενετικές και επίκτητες αιτίες. Τα αντιεπιληπτικά φάρμακα χρησιμοποιούνται για τη διαχείριση και θεραπεία της επιληψίας. Είναι πολυάριθμα και εμφανίζουν ποικίλους μηχανισμούς δράσης, μειώνοντας την πυροδότηση των νευρώνων και δρώντας είτε σε κανάλια ιόντων που συμμετέχουν στη δημιουργία δυναμικών δράσης, είτε ρυθμίζοντας τη συναπτική μετάδοση μέσω υποδοχέων. Παρά τον αυξανόμενο αριθμό των διαθέσιμων αντιεπιληπτικών φαρμάκων περίπου τρείς στους δέκα ασθενείς με επιληψία εξακολουθούν να υποφέρουν από την εμφάνιση της νόσου. Η ανθεκτική στα φάρμακα επιληψία (DRE) ορίζεται ως η επιμονή των επιληπτικών κρίσεων παρά τη χορήγηση τουλάχιστον δύο κατάλληλων αντισπασμωδικών φαρμάκων σε αποτελεσματική ημερήσια δόση. Η επαναλαμβανόμενη διακρανιακή μαγνητική διέγερση (rTMS) είναι μια μη επεμβατική μέθοδος διέγερσης του εγκεφαλικού φλοιού που μπορεί να επηρεάσει τη συναπτική πλαστικότητα δημιουργώντας εμμένοντα αποτελέσματα στον εγκέφαλο. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η in vitro μελέτη της συνδυαστικής επίδρασης αντιεπιληπτικών φαρμάκων με τη μέθοδο rTMS, στην κυτταρική σειρά νευροβλαστώματος ανθρώπινης προέλευσης SH-SY5Y. Το πείραμα περιλαμβάνει ένα in vitro μοντέλο επιληπτικής δραστηριότητας στη διαφοροποιημένη κυτταρική σειρά SH-SY5Y όπου διερευνήθηκαν οι μεταβολές στα ενδοκυτταρικά επίπεδα ασβεστίου χρησιμοποιώντας τον ευαίσθητο στο ασβέστιο δείκτη φθορισμού fluo-4, AM. Το πρωτόκολλο διαφοροποίησης της κυτταρικής σειράς προς έναν πιο ώριμο νευρωνικό φαινότυπο έγινε με τη χρήση ρετινοϊκού οξέος (RA) και του προερχόμενου από τον εγκέφαλο νευροτροφικού παράγοντα (BDNF). Η νευρωνική διέγερση έγινε με την προσθήκη χλωριούχου καλίου. Πραγματοποιήθηκαν τρεις πειραματικές διαδικασίες, μία με βάση το αντιεπιληπτικό φάρμακο διαζεπάμη, μία με βάση το αντιεπιληπτικό φάρμακο λακοσαμίδη και μία με βάση το αντιεπιληπτικό φάρμακο βαλπροϊκο οξύ. Οι κυτταρικές καλλιέργειες μελετήθηκαν υπό την επίδραση α. του rTMS χαμηλής συχνότητας (1Hz), β. της διαζεπάμης ή λακοσαμίδης, είτε γ. του συνδυασμού φαρμακευτικής θεραπείας με ερεθισμό. Μεταξύ των διαφορετικών συνθηκών έγινε στατιστική επεξεργασία για την αξιολόγηση των μέσων διαφορών φθορισμού των υπό μελέτη κυτταροκαλλιεργειών με χρήση του μη παραμετρικού τεστ Kruskal-Wallis. Στο πείραμα της διαζεπάμης, όταν το φάρμακο και το rTMS χρησιμοποιήθηκαν ταυτόχρονα, προέκυψε μεγαλύτερη μείωση στα ενδοκυτταρικά επίπεδα ασβεστίου σε σύγκριση με τα δείγματα ελέγχου, ενώ επίσης, όταν καθένα από αυτά χρησιμοποιήθηκε μεμονωμένα παρουσίασε κατώτερη αλλά ισχυρή επίδραση. Αντίστοιχα, ο συνδυασμός λακοσαμίδης και rTMS χαμηλής συχνότητας φάνηκε επίσης να έχει την υψηλότερη αποτελεσματικότητα, δείχνοντας τη χαμηλότερη ενδοκυτταρική αύξηση ασβεστίου, ακολουθούμενη από τη λακοσαμίδη όταν χρησιμοποιήθηκε μεμονωμένα και τέλος από το rTMS χωρίς φαρμακολογική παρέμβαση. Τόσο η διαζεπάμη όσο και το rTMS χαμηλής συχνότητας φαίνεται να έχουν την ικανότητα να ελέγχουν την επιληπτική δραστηριότητα in vitro, ενώ ο συνδυασμός τους αποδεικνύεται να είναι ο πιο αποτελεσματικός. Η λακοσαμίδη και το rTMS χαμηλής συχνότητας αποδείχθηκαν ικανά να ελέγξουν την προκαλούμενη επιληπτική δραστηριότητα. Ο συνδυασμός τους φαίνεται να έχει την υψηλότερη αποτελεσματικότητα έναντι μεμονωμένης φαρμακολογικής παρέμβασης ή εφαρμογής μαγνητικού συντονισμού. Η συνδυαστική αυτή χρήση μεταξύ φαρμάκου και rTMS θα μπορούσε να φανεί χρήσιμη ιδιαίτερα σε ασθενείς με ανθεκτική στα φάρμακα επιληψία, ώστε να γίνει πιο αποτελεσματική διαχείριση της νόσου τους. Τα αποτελέσματα αυτά καταδεικνύουν την ανάγκη για νέες προκλινικές ή κλινικές μελέτες.