Investigation of secondary metabolites in indigenous red winegrape varieties and effect of viticulture practices

Abstract

Grapes are the site of biosynthesis of a multitude of secondary metabolites that play an important role in determining the properties of wine (color, aroma and flavor). Secondary metabolites belong to a wide range of chemical groups, the most important of which are phenolics and volatile compounds. The concentration and profile of these compounds depend mainly on grape variety, but growing conditions also exert a significant effect. In particular, the exposure of grapes to light is a key factor in regulating their biosynthesis, however its effects vary depending on the intensity of exposure, the variety, the region, the type of metabolite and the developmental stage of the vine.The aim of this doctoral thesis was to investigate the effect of the light microclimate mediated by the application of leaf removal, on the levels and profile of secondary metabolites in the grapes and wines of four Greek red winegrape varieties (Xinomavro, Agiorgitiko, Mandilaria and Limniona, Vitis vinifera L.), during three consecutive years (2021-2022-2023). Two leaf-removal treatments were applied: LR, complete removal of leaves and lateral shoots in the first six nodes of the base of the primary shoot at 50% of veraison, and CO, control plants without leaf removal in a completely randomized factorial design. Grape samples collected at harvest and experimental wines from each treatment were analyzed by targeted and suspect screening using LC-QTOF-MS/MS for anthocyanins and other phenolic compounds as well as HS-SPME combined with GC–IT–MS for simultaneous determination of free and bound volatile compounds. ANOVA and chemometrics were applied to determine the effect of variety and leaf removal on secondary metabolite levels as well as to identify chemical “fingerprints” of the four varieties. According to the results, the anthocyanin profiles had distinct and consistent varietal differences. Specifically, the skins of Agiorgitiko and Xinomavro had a higher percentage of the more stable tri-hydroxylated and acetylated forms (~ 90%) while Mandilaria and Limniona had an increased proportion of di-hydroxylated anthocyanins. LR induced different responses among the four varieties, with Agiorgitiko presenting the most consistent increase and Limniona showing a positive effect only in 2021. Among the varietal wines, Agiorgitiko had the highest total anthocyanin concentration followed by Limniona, while no differences were observed between the LR treatments. Flavonols were the class of compounds with the most consistent response to changes in grape microclimate as with few exceptions, their concentration in the skin of the grapes increased with LR. In fact, according to the results of the suspect analysis, the dominant flavonols in all varieties of the study were those with the highest degree of methylation on the B ring. Similar were the results of the effect of LR on the levels of flavonols in the experimental wines. Regarding the two categories of phenolic acids, hydroxybenzoic acids appeared in greater number and concentration than hydroxycinnamic acids, which is probably related to the fact that the latter are mainly found in grape juice. The hydroxybenzoic acids increased in most cases with the LR, while the hydroxycinnamic acids showed a similar but less consistent trend. In contrast, this effect was not observed for the phenolic acids of the wines. The degree of polymerization depends mainly on the genotype and is only marginally affected by grape exposure. LR had no significant effect on flavan-3-ol levels in grapes and wines, while their average degree of polymerization showed reduced values compared to the control in Xinomavro and Agiorgitiko and no effect in Mandilaria and Limniona. Regarding volatile compounds, leaf removal showed an adverse effect the C6/C9 alcohols in most cases, both in free and bound form, known to confer a grassy aroma to the wines, whereas terpenoids (terpenes and C13 norisoprenoids) had an opposite trend. The compound category with the more consistent increase under leaf removal was the acetate esters contributing to the fruity aroma. Those results were not reproduced in wines. The lack of correspondence between grape and wine secondary metabolites, given the similar winery conditions, can be explained by the level of grape maturity. In conclusion, the results of the work show that both genotype and agronomic practices must be taken into account together in the understanding and management of grape phenolic and aroma compounds. In light of the climate crisis, knowledge of the metabolome of indigenous grape varieties and research into the response of various metabolites to climatic stresses will allow adaptation of viticulture to future conditions.

Τα σταφύλια είναι το σημείο βιοσύνθεσης πληθώρας δευτερογενών μεταβολιτών οι οποίοι παίζουν σημαντικό ρόλο στον καθορισμό των ιδιοτήτων του οίνου (χρώμα,άρωμα και γεύση). Οι δευτερογενείς μεταβολίτες ανήκουν σε ένα ευρύ φάσμα χημικών ομάδων, σπουδαιότερες εκ των οποίων για τους οίνους είναι τα φαινολικά και τα πτητικά συστατικά. Η συγκέντρωση αλλά και το προφίλ των ενώσεων αυτών εξαρτώνται κυρίως από την ποικιλία της αμπέλου αλλά σημαντική επίδραση έχουν και οι καλλιεργητικές συνθήκες. Ειδικότερα, η έκθεση των σταφυλιών στο φως αποτελεί βασικό παράγοντα ρύθμισης της βιοσύνθεσής τους ωστόσο τα αποτελέσματά της διαφέρουν ανάλογα με το μέγεθος της έκθεσης, την ποικιλία, την περιοχή, το είδος του μεταβολίτη και το αναπτυξιακό στάδιο της αμπέλου. Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση της επίδρασης του φωτεινού μικροκλίματος που προκαλείται από την εφαρμογή ξεφυλλίσματος, στα επίπεδα και το προφίλ των δευτερογενών μεταβολιτών στα σταφύλια και στους οίνους τεσσάρων γηγενών ερυθρών οινοποιήσιμων ποικιλιών αμπέλου (Ξινόμαυρο, Αγιωργίτικο, Μαντηλαριά και Λημνιώνα, Vitis vinifera L.), κατά τη διάρκεια τριών συνεχόμενων ετών (2021-2022-2023). Εφαρμόστηκαν δύο μεταχειρίσεις ξεφυλλίσματος: LR, πλήρης αφαίρεση των φύλλων και των ταχυφυών βλαστών στα πρώτα έξι γόνατα της βάσης του κυρίου βλαστού στο 50% του πέρκασμου, και CO, φυτά μάρτυρες χωρίς αφαίρεση φύλλων σε πλήρως τυχαιοποιημένο παραγοντικό σχέδιο. Δείγματα σταφυλιών που συλλέχθηκαν κατά τον τρυγητό και πειραματικών οίνων από κάθε μεταχείριση αναλύθηκαν με στοχευμένη και μη στοχευμένη σάρωση με τη χρήση LC-QTOF-MS/MS για τις ανθοκυανίνες και άλλες φαινολικές ενώσεις καθώς και με HS-SPME σε συνδυασμό με GC–IT–MS για ταυτόχρονο προσδιορισμό ελεύθερων και δεσμευμένων πτητικών ενώσεων. Εφαρμόστηκε ANOVA και πολυμεταβλητή χημειομετρία για τον προσδιορισμό της επίδρασης της ποικιλίας και του ξεφυλλίσματος στα επίπεδα των δευτερογενών μεταβολιτών καθώς και για την αποτύπωση χημικών «αποτυπωμάτων» των τεσσάρων ποικιλιών. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, τα προφίλ των ανθοκυανινών είχαν διακριτές και σταθερές ποικιλιακές διαφορές. Συγκεκριμένα, οι φλοιοί των ποικιλιών Αγιωργίτικο και το Ξινόμαυρο είχαν μεγαλύτερο ποσοστό των σταθερότερων τρι-υδροξυλιωμένων και ακετυλιωμένων μορφών (~ 90%) ενώ η Μαντηλαριά και η Λημνιώνα είχαν αυξημένη αναλογία δι-υδροξυλιωμένων ανθοκυανινών. Το ξεφύλλισμα προκάλεσε διαφορετικές αποκρίσεις μεταξύ των τεσσάρων ποικιλιών, με το Αγιωργίτικο να σημειώνει την πιο συνεπή αυξητική τάση και τη Λημνιώνα να εμφανίζει θετική επίδραση στο φως μόνο το 2021. Στους ποικιλιακούς οίνους το Αγιωργίτικο είχε την υψηλότερη συνολική συγκέντρωση ανθοκυανών ακολουθούμενο από την Λημνιώνα ενώ δεν παρατηρήθηκαν διαφορές ανάμεσα στις επεμβάσεις το ξεφυλλίσματος. Οι φλαβονόλες ήταν η κατηγορία ενώσεων με την πιο σταθερή απόκριση στις μεταβολές του μικροκλίματος των σταφυλιών καθώς, με ελάχιστες εξαιρέσεις, η συγκέντρωση τους στο φλοιό της ράγας αυξήθηκε με το ξεφύλλισμα. Μάλιστα σύμφωνα με τα αποτελέσματα της μη στοχευμένης ανάλυσης, οι κυρίαρχες φλαβονόλες σε όλες τις ποικιλίες της μελέτης ήταν αυτές που έχουν το μεγαλύτερο βαθμό μεθυλίωσης στον Β δακτύλιο. Παρόμοια ήταν και τα αποτελέσματα της επίδρασης του ξεφυλλίσματος στα επίπεδα φλαβονολών στα κρασιά. Σε ό,τι αφορά τις δύο κατηγορίες φαινολικών οξέων, τα υδροξυβενζοϊκά οξέα εμφανίστηκαν σε μεγαλύτερο αριθμό και συγκέντρωση από τα υδροξυκινναμωμικά οξέα, που πιθανότατα συνδέεται με το γεγονός ότι τα δεύτερα βρίσκονται κυρίως στον χυμό του σταφυλιού. Τα υδροξυβενζοϊκά οξέα της ράγας αυξήθηκαν στις επεμβάσεις του ξεφυλλίσματος στις περισσότερες περιπτώσεις ενώ τα υδροξυκινναμωμικά παρουσίασαν μία παρόμοια αλλά λιγότερο σταθερή τάση. Αντίθετα, η επίδραση αυτή δεν παρατηρήθηκε για τα φαινολικά οξέα των οίνων. Ο βαθμός πολυμερισμού εξαρτάται κυρίως από τον γονότυπο και επηρεάζεται μόνο οριακά από την έκθεση στο φως. Το ξεφύλλισμα δεν είχε σημαντική επίδραση στα επίπεδα των φλαβαν-3-ολών στα σταφύλια και τους οίνους ενώ ο μέσος βαθμός πολυμερισμού τους εμφάνισε μειωμένες τιμές σε σχέση με τον μάρτυρα σε Ξινόμαυρο και Αγιωργίτικo. Όσον αφορά τις πτητικές ενώσεις, η αφαίρεση των φύλλων μείωσε τις αλκοόλες C6/C9 στις περισσότερες περιπτώσεις, τόσο σε ελεύθερη όσο και σε δεσμευμένη μορφή, οι οποίες είναι γνωστό ότι προσδίδουν ένα χορτώδες άρωμα στους οίνους, ενώ τα τερπενοειδή (τερπένια και νορισοπρενοειδή C13) είχαν αντίθετη τάση. Η κατηγορία ενώσεων με την πιο συνεπή αύξηση κατά την αφαίρεση των φύλλων ήταν οι εστέρες οξικού οξέος που συνέβαλαν στο φρουτώδες άρωμα. Αυτά τα αποτελέσματα δεν αναπαράχθηκαν σε οίνους. Η έλλειψη αντιστοιχίας μεταξύ δευτερογενών μεταβολιτών σταφυλιού και κρασιού, δεδομένων των παρόμοιων συνθηκών οινοποίησης, μπορεί να εξηγηθεί από το επίπεδο ωριμότητας των σταφυλιών. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της εργασίας δείχνουν ότι τόσο ο γονότυπος όσο και οι αγρονομικές πρακτικές πρέπει να λαμβάνονται υπόψη από κοινού στην κατανόηση και διαχείριση των φαινολικών και αρωματικών ενώσεων του σταφυλιού. Υπό το πρίσμα της κλιματικής κρίσης, η γνώση του μεταβολώματος των γηγενών ποικιλιών αμπέλου και η έρευνα της απόκρισης των διαφόρων μεταβολιτών στην κλιματική πίεση θα επιτρέψει την προσαρμογή της αμπελουργίας στις μελλοντικές συνθήκες.