Ανάπτυξη, αξιολόγηση, in silico μελέτες αναστολέων λιποξυγονάσης/τυροσινάσης για πιθανή τοπική θεραπεία δερματικών παθήσεων

Abstract

The skin is considered the largest organ in the human body, so skin diseases pose a challenge to the scientific community. Inflammatory skin diseases such as psoriasis affect a large part of the global population. Although the condition is not life-threatening, it burdens the patient's daily life. Often, chronic skin inflammation leads to changes in skin color, specifically hyperpigmentation. Taking these skin abnormalities as our starting point, we focused our study on the action of two enzymes and their involvement in the pathophysiology of these conditions. These are lipoxygenases, a family of metalloenzymes that play an important role in the onset and intensification of inflammation. These are iron-containing enzymes that control the oxidation of polyunsaturated fatty acids such as arachidonic acid, thereby initiating the production of inflammatory mediators. The second enzyme studied is tyrosinase, a copper-containing metalloenzymes that is responsible for the production of melanin in the skin. It therefore plays a key role in skin hyperpigmentation. However, what prompted us to study these two enzymes simultaneously is the connection between them. More specifically, after years of skin inflammation, the oxidation products of arachidonic acid and their metabolites induce melanin production in melanocytes through the activation of tyrosinase. This phenomenon is called post-inflammatory hyperpigmentation. The aim of our study was to find compounds that act multifunctionally and can target both enzymes simultaneously. At the same time, we sought to find a more effective method of topical administration for the treatment of psoriasis and hyperpigmentation. We therefore selected three thiosemicarbazones with proven inhibitory activity from in vitro studies on the enzymes mentioned above. Our goal was to incorporate them into the innovative drug formulation we developed. This is a polymeric membrane produced by electrospinning, a process in which the polymer solution is converted into nanofibers under the influence of an electrostatic field. The nanofibers ensure a more controlled and uniform release of the active substance, and the application of these membranes is faster and easier than existing topical therapeutic approaches. The polymers we used were Poloxamer 407 and PVP K90 in a 30/70 ratio and were selected based on their biocompatibility and the morphology of the fibers they produce. After the membrane was developed, physicochemical tests were carried out on both pure polymer membranes and those containing the active substance in order to identify possible interactions between materials and the form in which the compound is found when incorporated into the polymers. The results we obtained were considered satisfactory.In the continuation of our study, we examined a series of tyrosinase inhibitors with proven in vitro inhibitory activity from the literature (Zolghadri et al, 2019) in order to develop their in silico profile. Also, using QSAR structure-activity relationships, we examined their ability to inhibit lipoxygenase, i.e. to act as multifunctional molecules. We used several in silico programs to obtain more reliable and repeatable results. The programs are as follows: Molinspiration, Molsoft, MedChem, SwissAdme and Preadmet, and the categories of compounds examined are Coumarin Derivatives, Chalcone Derivatives, Resveratrol Analogues, Piperidine Derivatives, Thiosemicarbazone Derivatives, Thiourea Derivatives, Thiazolidine Derivatives, Kojic Acid Analogues, and Benzaldehyde Derivatives. The in silico profile was developed for all compounds presented in the literature (Zolghadri et al, 2019), but we chose to present only the most potent ones based on IC50 on tyrosinase in our study. Emphasizing on predictions for drug-likeness and the ability to be administered topically, we arrived at the most promising categories. These are coumarin derivatives, chalcone derivatives and resveratrol analogues. From these categories, we selected the most potent compounds from each structural subcategory and studied them in silico in order to find the optimal molecules. Their profile was compared with that of Zileuton, a reference molecule for the inhibitory action on lipoxygenase, and tranexamic acid, a reference molecule for the inhibitory action on tyrosinase. We then examined whether these molecules could inhibit lipoxygenase through a series of QSAR relationships-structure QSAR and concluded that Coumarin Derivative 16 and the modified product Chalcone 13 are expected to be the most potent LOX inhibitors. We conducted molecular modelling studies on these compounds and on some others that showed reduced activity from the QSAR relationships to verify the prediction and understand how the molecules interact with lipoxygenase. The aromatic system of Coumarin Derivatives 15 and 16, in combination with the hydroxyl groups, ensures strong binding near the active site of the enzyme. However, the prediction that they are not able to cross the skin barrier from all predictive models is problematic. As for the Resveratrol Analogues, all molecules are expected to cross the blood-brain barrier, suggesting that they may cause neurological side effects and, at the same time, Molsoft does not predict that they will have a therapeutic effect, i.e. act as drugs. After comparing the results from all compounds, we conclude that the most promising molecule is the modified chalcone product, compound 13. This is a pleiotropic molecule that targets both enzymes, lipoxygenase and tyrosinase. It is predicted to be capable of providing a therapeutic effect according to drug-likeness studies and has a satisfactory profile in relation to dermal administration. More specifically, according to Molsoft, it is more likely to act as a drug than tranexamic acid. It is also important to note that the Brenk and Pains predictions do not identify any problems with its structure. It could therefore be an excellent candidate for a new compound for the treatment of psoriasis and skin hyperpigmentation, and it would be worthwhile to continue studying it in subsequent stages.

Το δέρμα θεωρείται το μεγαλύτερο όργανο στον ανθρώπινο οργανισμό, συνεπώς οι παθήσεις αυτού αποτελούν πρόκληση για την επιστημονική κοινότητα. Φλεγμονώδη νοσήματα του δέρματος όπως η ψωρίαση απασχολούν μεγάλο τμήμα του πληθυσμού παγκοσμίως. Παρόλο που η πάθηση δεν είναι απειλητική για τη ζωή επιβαρύνει την καθημερινότητά του ασθενή. Συχνά, χρόνιες φλεγμονές του δέρματος οδηγούν σε αλλαγές της χρώσης του και συγκεκριμένα στον υπερχρωματισμό του. Έχοντας ως αφετηρία τις δερματικές αυτές ανωμαλίες επικεντρώσαμε τη μελέτη μας στη δράση δύο ενζύμων και στην εμπλοκή αυτών στην παθοφυσιολογία τους. Πρόκειται για τις λιποξυγονάσες, μια οικογένεια μεταλλοενζύμων με σημαντική εμπλοκή στην εμφάνιση και την ενίσχυση της φλεγμονής. Είναι ένζυμα που περιέχουν σίδηρο και ελέγχουν την οξείδωση πολυακόρεστων λιπαρών οξέων όπως το αραχιδονικό οξύ, εκκινώντας έτσι την παραγωγή φλεγμονωδών μεσολαβητών. Το δεύτερο ένζυμο που μελετήθηκε είναι η τυροσινάση, ένα μεταλλοένζυμο που περιέχει χαλκό και είναι υπεύθυνο για την παραγωγή μελανίνης στο δέρμα. Διαδραματίζει λοιπόν καίριο ρόλο στην υπερμελάγχρωση του δέρματος. Αυτό που μας ώθησε όμως στην ταυτόχρονη μελέτη των δύο αυτών ενζύμων είναι η σύνδεση που υπάρχει μεταξύ τους. Πιο συγκεκριμένα, ύστερα από χρόνια φλεγμονή του δέρματος, τα προϊόντα οξείδωσης του αραχιδονικού οξέος και οι μεταβολίτες τους επάγουν την παραγωγή μελανίνης στα μελανοκύτταρα μέσω ενεργοποίησης της τυροσινάσης. Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται μεταφλεγμονώδης υπερμελάγχρωση. Στόχος την μελέτης μας ήταν η εύρεση ενώσεων που δρουν πολυλειτουργικά και μπορούν ταυτόχρονα να στοχεύουν και τα δύο ένζυμα. Ταυτόχρονα, επιδιώξαμε την εύρεση πιο αποτελεσματικής μεθόδου για τοπική χορήγηση για τη θεραπεία της ψωρίασης και της υπερμελάγχρωσης. Επιλέξαμε λοιπόν τρεις θειοσεμικαρβαζόνες με αποδεδειγμένη ανασταλτική δράση από in vitro μελέτες επί των ενζύμων που αναφέρθηκαν. Σκοπός μας ήταν να τις ενσωματώσουμε στην καινοτόμο φαρμακομορφή που αναπτύξαμε. Πρόκειται για ένα πολυμερικό υμένιο που παράχθηκε μέσω ηλεκτροϊνοποίησης, μια διαδικασία κατά την οποία το πολυμερικό διάλυμα μετατρέπεται σε νανοΐνες υπό την επίδραση ηλετροστατικού πεδιου. Οι νανοΐνες εξασφαλίζουν πιο ελεγχόμενη και ομοιόμορφη απελευθέρωση της δραστικής ουσίας και η εφαρμογή των υμενίων αυτών είναι πιο γρήγορη και εύκολη από τις υπάρχουσες τοπικές θεραπευτικές προσεγγίσεις. Τα πολυμερή που χρησιμοποιήσαμε ήταν το Poloxamer 407 και το PVP K90 σε αναλογία 30/70 και επιλέχθηκαν με βάση τη βιοσυμβατότητα τους και την μορφολογία των ινών που παράγουν. Αφότου αναπτύχθηκε το υμένιο διεξήχθησαν φυσικοχημικοί έλεγχοι τόσο σε αμιγώς πολυμερικά υμένια όσο και σε αυτά που περιείχαν δραστική ώστε να διαπιστώσουμε πιθανές αλληλεπιδράσεις υλικών αλλά και τη μορφή στην οποία βρίσκεται η ένωση όταν ενσωματώνεται στα πολυμέρη. Τα αποτελέσματα που λάβαμε κρίθηκαν ικανοποιητικά.Στη συνέχεια της μελέτης μας, εξετάσαμε μια σειρά αναστολέων τυροσινάσης με αποδεδειγμένη in vitro ανασταλτική δράση από τη βιβλιογραφία (Zolghadri et al, 2019) με σκοπό να αναπτύξουμε το in silico προφίλ τους. Επίσης με τη χρήση QSAR σχέσεων δράσης-δομής εξετάσαμε την ικανότητα τους να αναστέλλουν και τη λιποξυγονάση, να δρουν δηλαδή ως πολυλειτουργικά μόρια. Χρησιμοποιήσαμε πολλά in silico προγράμματα ώστε να εξάγουμε πιο αξιόπιστα και επαναλήψιμα αποτελέσματα. Τα προγράμματα είναι τα εξής : Molinspiration, Molsoft, MedChem, SwissAdme και Preadmet και οι κατηγορίες ενώσεων που εξετάστηκαν είναι τα Παράγωγα Κουμαρινών, τα Παράγωγα Χαλκονών, τα Ανάλογα Ρασβερατρόλης, τα Παράγωγα Πιπεριδίνης, τα Παράγωγα Θειοσεμικαρβαζόνης, τα Παράγωγα Θειουρίας, τα Παράγωγα Θειαδιαζολινών, τα Ανάλογα Κοΐκού Οξέος και τα Παράγωγα Βενζαλδεΰδης. Αναπτύχθηκε το in silico προφίλ για όλες τις ενώσεις που παρουσιάζονται στη βιβλιογραφία (Zolghadri et al, 2019) αλλά επιλέξαμε να παρουσιάσουμε στη μελέτη μας μόνο των πιο δραστικών με βάση την IC50 επί τυροσινάσης. Δίνοντας έμφαση στις προβλέψεις για τη φαρμακοομοιότητα και την ικανότητα να χορηγούνται τοπικά καταλήξαμε στις πιο υποσχόμενες κατηγορίες. Πρόκειται για τα Παράγωγα Κουμαρινών, τα Παράγωγα Χαλκονών και τα Ανάλογα Ρεσβερατρόλης. Από τις κατηγορίες αυτές διαλέξαμε τις πιο δραστικές από κάθε δομική υποκατηγορία και τις μελετήσαμε in sιlico με σκοπό να βρούμε τα βέλτιστα μόρια. Το προφίλ τους συγκρίθηκε με του Ζileuton, μόριο αναφοράς για την ανασταλτική δράση επί της λιποξυγονάσης και του τρανεξαμικού οξέος, μόριο αναφοράς για την ανασταλτική δράση επί της τυροσινάσης. Στη συνέχεια εξετάσαμε εάν τα μόρια αυτά θα μπορούσαν να αναστείλουν τη λιποξυγονάση μέσω μιας σειράς σχέσεων δράσης-δομής QSAR και καταλήξαμε ότι το Παράγωγο Κουμαρίνης 16 και το τροποποιημένο προϊόν Χαλκόνης 13 αναμένεται να είναι τα πιο δραστικά επί LOX. Διεξήγαμε μελέτες μοριακής μοντελοποίησης στις ενώσεις αυτές και σε ορισμένες άλλες που παρουσίασαν μειωμένη δράση από τις σχέσεις QSAR για να διαπιστώσουμε εάν επαληθεύεται η πρόβλεψη και να κατανοήσουμε τον τρόπο που αλληλοεπιδρούν τα μόρια με τη λιποξυγονάση. Το αρωματικό σύστημα των Παραγώγων Κουμαρινών 15 και 16 σε συνδυασμό με τις υδροξυλομάδες εξασφαλίζουν ισχυρή πρόσδεση πλησίον του ενεργού κέντρου του ενζύμου. Ωστόσο, η πρόβλεψη να μην είναι ικανά να διαπεράσουν τον δερματικό φραγμό από όλα τα προγνωστικά μοντέλα είναι προβληματική. Ως προς τα Ανάλογα Ρεσβερατρόλης όλα τα μόρια αναμένεται να διαπερνούν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό, προμηνύοντας ότι μπορεί να προκαλέσουν παρενέργειες νευρολογικής φύσης και ταυτόχρονα για όλα τα το Molsoft δεν προβλέπει να έχουν θεραπευτικό αποτέλεσμα, να δρουν δηλαδή ως φάρμακα. Καταλήγουμε λοιπόν στο συμπέρασμα αφότου έχουμε συγκρίνει τα αποτελέσματα από όλες τις ενώσεις ότι το πιο υποσχόμενο μόριο είναι το τροποποιημένο προϊόν χαλκόνης η ένωση 13. Πρόκειται για ένα πλειοτροπικό μόριο που στοχεύει ταυτόχρονα και τα δύο ένζυμα, την λιποξυγονάση και την τυροσινάση. Προβλέπεται να είναι ικανό να παρέχει θεραπευτικό αποτέλεσμα σύμφωνα με τις μελέτες φαρμακοομοιότητας και έχει ικανοποιητικό προφίλ σε σχέση με την δερματική χορήγηση. Πιο συγκεκριμένα, σύμφωνα με το Μolsoft έχει μεγαλύτερη πιθανότητα να δράσει ως φάρμακο σε σχέση με το τρανεξαμικό οξύ. Σημαντικό επίσης είναι ότι οι προβλέψεις Brenk και Pains δεν αναγνωρίζουν πρόβλημα στη δομή της. Θα μπορούσε λοιπόν να αποτελέσει μια εξαιρετική υποψήφια νέα ένωση για την θεραπεία της ψωρίασης και της υπερμελάγχρωσης του δέρματος και θα άξιζε να συνεχιστεί η μελέτη του και σε επόμενα στάδια.