Identification and functional characterization of long non-coding RNAs that are involved in intestinal homeostasis and carcinogenesis

Abstract

Long non-coding RNAs (lncRNAs) are transcripts longer than 200 nucleotides, without protein-coding potential. They are frequently spliced, polyadenylated, 5’capped, yet they lack evolutionary conservation and exhibit tissue-specific expression. LncRNAs regulate diverse biological processes and signalling pathways, and their deregulation is often linked to diseases, such as cancer. The Wnt/β-catenin pathway is a key regulator of intestinal stem cell maintenance and epithelial self-renewal, with the β-catenin/TCF4 complex orchestrating the expression of critical target genes. Aberrant activity of the Wnt pathway, due to mutations that stabilize β-catenin expression, is the major driver of colorectal carcinogenesis (CRC). Several lncRNAs have been identified as modulators of Wnt signaling, affecting its transcriptional repertoire and carcinogenesis. Even though lncRNAs are typically considered non-coding, emerging studies have revealed the presence of small open reading frames (smORFs) residing within lncRNA loci (lncORFs), expressing microproteins. These microproteins represent an underappreciated class of biomolecules with critical roles in fundamental physiological and molecular processes. In the first part of the thesis, we identified LINC01133 (lnc-IGSF9) as a nuclear lncRNA whose locus is bound by the β-catenin/TCF4 complex and its expression is negatively regulated by the Wnt pathway activity in CRC cells. CRISPR-a-mediated overexpression revealed that lnc-IGSF9 promotes cell adhesion and differentiation, reduces cell proliferation, and perturbs Wnt initiation. We discovered that lnc-IGSF9 operates in cis, regulating the expression of its neighboring gene IGSF9, which encodes a cell adhesion protein. Both transcripts are co-expressed across different tissues, and are downregulated in CRC patients, suggesting that both lnc-IGSF9 and IGSF9 are commonly regulated. Mechanistically, RNA pull-down followed by mass spectrometry demonstrated that lnc-IGSF9 interacts with CDX2, an intestinal-specific orchestrator of differentiation. CDX2 overexpression induces the expression of lnc-IGSF9 and subsequently, increases the IGSF9 expression levels. Our findings suggest that the CDX2-lnc-IGSF9-IGSF9 axis is a novel regulator of intestinal differentiation. In the second part, we examined the existence of lncORFs in cancer cells by leveraging Ribo-seq experiments from HCT116 cells treated with Cycloheximide or Lactimidomycin. ORF-RATER and Ribosome Release Score (RRS) analyses identified multiple lncORFs with coding potential. Among the seven manually curated candidates, only EPB41L4A-AS1 lncRNA was validated to encode a mitochondrial microprotein (EPB-SEP). Functional assays demonstrated that EPB-SEP overexpression disrupts mitochondrial membrane potential, induces G2 cell-cycle arrest, and reduces clonogenicity, while the shRNA-mediated knockdown of EPB41L4A-AS1 enhances proliferation. Proteomic profiling revealed that EPB-SEP predominantly impairs the mitoproteome and dysregulates mitosis-associated proteins. Immunoprecipitation experiments revealed that EPB-SEP interacts with several mitochondrial proteins essential for mitochondrial homeostasis. Together, these results uncover EPB-SEP as a novel tumor-suppressive mitochondrial microprotein encoded by EPB41L4A-AS1.

Τα Μακρά Μη-Κωδικά RNA (lncRNAs) είναι μετάγραφα μήκους άνω των 200 νουκλεοτιδίων που δεν μεταφράζονται σε πρωτεΐνη. Παρουσιάζουν κοινά χαρακτηριστικά με τα αγγελιοφόρα RNA (mRNA), όπως το μάτισμα, τη πολυαδενυλίωση του 3’ άκρου και την προσθήκη 5’ καλύπτρας. Παρόλα αυτά, σε πολλές περιπτώσεις δεν είναι εξελικτικά συντηρημένα και εμφανίζουν ιστοειδική έκφραση. Τα lncRNAs έχουν φανεί να εμπλέκονται στη ρύθμιση πολλών βιολογικών φαινομένων και σηματοδοτικών μονοπατιών, ενώ η απορρύθμιση τους έχει συνδεθεί με νοσήματα, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Το σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt/β-κατενίνη αποτελεί βασικό ρυθμιστή της ομοιόστασης των βλαστοκυττάρων του εντερικού επιθηλίου και της ικανότητας του να αναγεννάται, καθώς ενορχηστρώνει την έκφραση πολλών σχετικών γονιδίων-στόχων. Η συνεχής ενεργοποίηση του μονοπατιού, εξαιτίας μεταλλάξεων που σταθεροποιούν την β-κατενίνη, αποτελεί μια από τις κυρίαρχες αιτίες της καρκινογένεσης του παχέος εντέρου (CRC). Έχει διαπιστωθεί πως πολλά lncRNAs ρυθμίζουν το μονοπάτι Wnt, επηρεάζοντας το μοριακό του αποτύπωμα και ρυθμίζοντας τελικά την καρκινογένεση. Παρόλο που τα lncRNAs χαρακτηρίζονται ως μη κωδικά, πρόσφατες μελέτες ανέδειξαν την παρουσία μικρών πλαισίων ανάγνωσης (smORFs) σε γενετικούς τόπους ορισμένων γονιδίων-lncRNA (lncORFs) τα οποία μεταφράζονται σε μικροπρωτεΐνες. Αυτές οι μικροπρωτεΐνες αποτελούν μια νέα κλάση βιομορίων με σημαντικό ρόλο σε πολλαπλές βιολογικές και μοριακές λειτουργίες. Στο πρώτο μέρος της παρούσας διατριβής, ταυτοποιήσαμε το LINC01133 (lnc-IGSF9) ως ένα πυρηνικό lncRNA του οποίου ο γενετικός τόπος περιέχει θέσεις πρόσδεσης από το σύμπλοκο β-κατενίνη/TCF4 και η έκφραση του ρυθμίζεται αρνητικά από το μονοπάτι Wnt. Η υπερέκφραση του μέσω CRISPR-a φανέρωσε ότι το μετάγραφο lnc-IGSF9 μειώνει τον πολλαπλασιασμό και προάγει τη διαφοροποίηση των CRC, ενώ αναστέλλει την ενεργοποίηση του μονοπατιού Wnt. Ανακαλύψαμε ότι το lnc-IGSF9 δρα in cis, ρυθμίζοντας την έκφραση του γειτονικού γονιδίου IGSF9, το οποίο κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη κυτταρικής προσκόλλησης. Τα δύο μετάγραφα συν-εκφράζονται σε πολλούς ιστούς και είναι κατεσταλμένα σε ασθενείς με CRC. Μηχανιστικά, πειράματα ανοσοκατακρήμνισης του RNA έδειξαν ότι το lnc-IGSF9 αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη CDX2 η οποία δρα ως κυρίαρχος ρυθμιστής της εντερικής διαφοροποίησης. Η υπερέκφραση της CDX2 επάγει την έκφραση του lnc-IGSF9 και αυτό με τη σειρά του, αυξάνει τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου IGSF9. Τα δεδομένα μας υποδεικνύουν ότι ο άξονας CDX2–lnc-IGSF9–IGSF9 αποτελεί έναν σημαντικό ρυθμιστικό μηχανισμό της εντερικής διαφοροποίησης και της βιολογίας του CRC. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής εξετάσαμε την ύπαρξη κωδικών lncORFs στα καρκινικά κύτταρα. Ειδικότερα, αξιοποιήσαμε πειράματα ριβοσωμικού προφίλ (Ribo-seq) από κύτταρα HCT116 στα οποία είχε χορηγηθεί Κυκλοεξιμίδιο ή Λακτιμιδομυκίνη. Με τη χρήση των ORF-RATER και Ribosome Release Score (RRS) ταυτοποιήσαμε πολλαπλά lncORFs με δυνητική μεταφραστική δραστηριότητα. Ανακαλύψαμε ότι το lncRNA EPB41L4A-AS1 κωδικοποιεί μια νέα μιτοχονδριακή μικροπρωτεΐνη (EPB-SEP). Παρατηρήσαμε ότι η υπερέκφραση της μειώνει το μεμβρανικό δυναμικό των μιτοχονδρίων και τη κλωνογενετικότητα των καρκινικών κυττάρων, ενώ προάγει τη στάση του κυτταρικού κύκλου στο στάδιο G2. Αντίθετα, η καταστολή του EPB41L4A-AS1 μέσω shRNA ενισχύει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Η υπερέκφραση της EPB-SEP οδηγεί στη καταστολή πολλών μιτοχονδριακών πρωτεϊνών, καθώς και την απορρύθμιση μιτωτικών παραγόντων. Πειράματα ανοσοκατακρήμνισης έδειξαν ότι η EPB-SEP αλληλεπιδρά με αρκετές μιτοχονδριακές πρωτεΐνες κρίσιμες για τη μιτοχονδριακή ομοιόσταση. Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά αναδεικνύουν την EPB-SEP ως μια νέα μιτοχονδριακή μικροπρωτεΐνη που κωδικοποιείται από το EPB41L4A-AS1 και έχει ογκοκατασταλτική δράση.