Investigation of the expression profiles and functional significance of long non-coding RNAs (IncRNAs) in the pathophysiology of pancreatic cancer stem cells

Abstract

PDAC is one of the most lethal cancers and is expected to become the second leading cause of cancer that is related with mortality in the United States by 2030. The aggressiveness of PDAC is mainly due to the tumour’s high invasive capacity, which quickly leads to metastasis, and its resistance to conventional chemotherapy and radiotherapy. The presence of CSCs within the tumor is considered one of the main factors that limit the treatment of solid tumors, including PDAC, and leads to tumor recurrence. Therefore, the identification and target therapy of CSCs could be of strategic importance for preventing recurrence and metastasis of the malignancy. LncRNAs are expressed in a tissue-specific and controllable manner, while they are involved in the regulation of gene expression at epigenetic, transcriptional, and post-transcriptional levels through a variety of mechanisms. Many of the lncRNA target genes have direct implications in cancer and their expression levels affect the basic properties of cancer cells, such as tumor cell proliferation, survival, metastasis, and response to host immune surveillance, or conventional chemotherapeutics. However, the expression patterns and the role of lncRNAs in the pathophysiology of CSCs, including PCSCs, remain largely unexplored. Based on the above, the identification of novel lncRNAs that can serve as biomarkers is of particular research interest.This doctoral thesis investigates the expression profiles and functional relevance of lncRNAs in PCSCs, with a specific focus on CD133+/CD44+ PDAC cell population. In the first part of this work, CD133+/CD44+ cells were successfully isolated from PDAC cell lines and characterized phenotypically and molecularly. Genome-wide analyses of mRNA/lncRNA transcriptome profiling and co-expression networks in CD133+/CD44+ cells shown to bear a CSC-like phenotype in vitro and in vivo. Compared to CD133-/CD44- cells, the CD133+/CD44+ population demonstrated significant expression differences in both transcript pools. Using emerging bioinformatic tools, we performed lncRNA target coding gene prediction analysis, which revealed significant Gene Ontology, pathway, and network enrichments in many dysregulated lncRNA nearby (cis or trans) mRNAs, with reported involvement in the regulation of CSC phenotype and functions. In this context, the construction of lncRNA/mRNA networks by ingenuity platforms identified the lncRNAs ATF2, CHEK1, DCAF8, and PAX8 to interact with “hub” SC-associated mRNAs. In addition, the expressions of the above lncRNAs retrieved by TCGA-normalized RNAseq gene expression data of PAAD were significantly correlated with clinicopathological features of PDAC, including tumor grade and stage, nodal metastasis, and overall survival.The second part of this study focused on the functional characterization of one novel lncRNA, AK057887, which was significantly upregulated in CD133+/CD44+ cells. Our findings report on the role of the lncRNA AK057887 in maintaining the stemness and chemoresistance of the highly aggressive CD133+/CD44+ PDAC population, as well as the underlying molecular mechanism of its action. AK057887 silencing resulted in significant inhibition of CD133+/CD44+ PDAC cell proliferation, migration and tumorsphere formation, as well as increased sensitivity to Gemcitabine in vitro and in vivo. Although, AK057887 expression was found considerably downregulated in less advanced PDAC tissues compared to normal counterparts, positive correlations were established between AK057887 levels and tumor stage and nodal metastasis. Furthermore, using transcriptomic microarray and bioinformatic analyses we unveiled significant Gene Ontology, pathway and network enrichments in many dysregulated mRNAs that may be affected by AK057887 dysregulation, while we identified IGFR-1/p38α/p53 signaling axis as a putative AK057887 target, through which AK057887 might mediate its chemoprotective action in PDAC.Overall, the findings of this thesis shed light on the lncRNA landscape of pancreatic CSCs and identify AK057887 as a novel functional regulator of PDAC stemness and chemoresistance. These results contribute to the growing body of evidence supporting the clinical potential of lncRNAs as biomarkers and therapeutic targets. Understanding lncRNA-mediated mechanisms in CSCs could provide valuable insights into PDAC pathophysiology and pave the way for the development of more effective, targeted therapies for this devastating disease.

Το παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα (ΠΑΚ) αποτελεί μία από τις πιο επιθετικές και θανατηφόρες μορφές καρκίνου, κυρίως λόγω της καθυστερημένης διάγνωσης του, της υψηλής μεταστατικής του ικανότητας και της ανθεκτικότητάς του στις συμβατικές θεραπείες. Τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΒΚ), που αποτελούν ένα μικρό πληθυσμό κυττάρων εντός των όγκων, διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στην επιθετικότητα, την υποτροπή και τη χημειοαντοχή του ΠΑΚ. Τα μακρά μη κωδικοποιητικά RNA (lncRNAs), μια ετερογενής κατηγορία μεταγράφων άνω των 200 νουκλεοτιδίων, χωρίς δυνατότητα μετάφρασης σε πρωτεΐνες, έχουν αναδειχθεί πρόσφατα ως βασικοί ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης και της κυτταρικής λειτουργίας. Ωστόσο, ο ρόλος τους στα παγκρεατικά καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΠΚΒΚ) παραμένει σε μεγάλο βαθμό αδιευκρίνιστος. Η παρούσα διδακτορική διατριβή μελετά τα προφίλ έκφρασης και τη λειτουργική σημασία των lncRNAs στα ΠΚΒΚ, με έμφαση στα CD133+/CD44+ κύτταρα του ΠΑΚ. Στο πρώτο μέρος, απομονώθηκαν επιτυχώς τα CD133+/CD44+ κύτταρα από κυτταρικές σειρές ΠΑΚ και χαρακτηρίστηκαν φαινοτυπικά και μοριακά. Η ανάλυση του μεταγραφώματος σε επίπεδο mRNA/lncRNA και των δικτύων συνέκφρασης γονιδίων κατέδειξε πως αυτά τα κύτταρα φέρουν φαινότυπο ΚΒΚ τόσο σε επίπεδο in vitro όσο και in vivo. Συγκριτικά με τα CD133-/CD44- κύτταρα, ο CD133+/CD44+ πληθυσμός παρουσίασε σημαντικές διαφορές στην έκφραση μεταγράφων. Μέσω βιοπληροφορικής ανάλυσης προβλέφθηκαν οι στόχοι των lncRNAs με σημασία σε λειτουργικές κατηγορίες, μονοπάτια και δίκτυα, με έμφαση σε ρυθμιστικές δράσεις σε mRNAs που σχετίζονται με το ΚΒΚ φαινότυπο. Δίκτυα lncRNA/mRNA αποκάλυψαν πιθανές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των lncRNAs ATF2, CHEK1, DCAF8 και PAX8 με “κεντρικά” mRNAs. Επιπλέον, η ανάλυση δεδομένων RNAseq από την TCGA έδειξε συσχέτιση των παραπάνω lncRNAs με κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά του ΠΑΚ, όπως το στάδιο της ασθένειας και την επιβίωση των ασθενών. To δεύτερο μέρος της μελέτης, εστίασε στη λειτουργική διερεύνηση του lncRNA AK057887, το οποίο βρέθηκε σημαντικά αυξημένο σε έκφραση στα CD133+/CD44+ κύτταρα. Τα ευρήματά μας καταδεικνύουν ότι το AK057887 συμβάλλει στη διατήρηση της βλαστικότητας και της χημειοανθεκτικότητας του CD133+/CD44+ ΠΑΚ πληθυσμού. Η σίγηση του AK057887 οδήγησε σε σημαντική μείωση της κυτταρικής αύξησης, της μετανάστευσης και της ικανότητας σχηματισμού ογκοσφαιριδίων, καθώς και σε αύξηση της ευαισθησίας στην Gemcitabine, τόσο σε επίπεδο in vitro, όσο και σε in vivo. Αν και το AK057887 ήταν χαμηλά εκφρασμένο σε λιγότερο προχωρημένα στάδια της νόσου, παρατηρήθηκε θετική συσχέτιση της έκφρασής του με το στάδιο και τη λεμφαδενική μετάσταση. Τέλος, η ανάλυση μικροσυστοιχιών mRNA και οι επακόλουθες βιοπληροφορικές αναλύσεις εντόπισαν εμπλουτισμένα γονιδιακά μονοπάτια και δίκτυα, προτείνοντας τον άξονα σηματοδότησης IGFR-1/p38α/p53 ως πιθανό στόχο μέσω του οποίου το AK057887 ασκεί τη χημειοπροστατευτική του δράση στο ΠΑΚ. Συνολικά, η παρούσα διατριβή προσφέρει νέες γνώσεις στο πεδίο των lncRNAs που εκφράζονται στα ΠΚΒΚ. Ειδικότερα, αναδεικνύει το AK057887 ως νέο λειτουργικό ρυθμιστή της βλαστικότητας και της χημειοανθεκτικότητας στο ΠΑΚ. Τα ευρήματα μας συμβάλλουν στην ανάδειξη και αξιοποίηση των lncRNAs ως βιοδείκτες και θεραπευτικούς στόχους ανοίγοντας νέες προοπτικές για πιο αποτελεσματικές και στοχευμένες θεραπευτικές παρεμβάσεις σε αυτή τη θανατηφόρα νόσο.