Optical immunosensors for the detection of harmful agents in food

Abstract

Identifying potential hazards (such as toxins or bacteria) in the food supply chain is of utmost importance for both the food industries and the consumers. These harmful substances can cause severe illnesses to humans through the consumption of contaminated food. To ensure quality maintenance and food safety, the European Union (EU) has established maximum permissible limits for food contaminants in products prone to contamination, such as milk, where the presence of microorganisms is strictly prohibited. To this end, the aim of this thesis is the development and application of an advanced optical Broad-Band Mach-Zehnder Interferometric (MZI) immunosensor for the detection of milk adulteration, aflatoxin M1 (AFM1), Salmonella typhimurium, and Escherichia coli O157:H7 in milk. The sensor is based on silicon chips integrating two U-shaped silicon nitride waveguides configured at some point as MZIs. The sensing windows of both MZIs are located at the one end of the chip, allowing the immersion of the chip into the sample. The chips are butt-coupled to a broad-band white LED and a spectrophotometer through a bifurcated optical fiber. The combined transmission spectrum of both MZIs is continuously recorded during the assay and subjected to Fast Fourier Transform to identify the wavenumbers of the two spectra, thereby enabling real-time monitoring of the phase shift of each MZI. In all cases, a competitive immunoassay format was followed, and all assay parameters were optimized. The detection of goat, sheep and donkey milk adulteration with cow milk, was performed through immobilization of bovine κ-casein onto one of the MZIs (working sensor), while for AFM1 detection a protein conjugate was immobilized onto the working sensor. In both cases, the second MZI was modified with bovine serum albumin, serving as reference sensor. In the case of bacteria detection, both interferometers were used as working sensors through modification with the lipopolysaccharide of the two bacteria in order to achieve their simultaneous detection. The experimental results highlight the reliable performance of the sensor, characterized by short assay duration and high sensitivity, consistently meeting the limits set by the EU for all targeted analytes. The excellent analytical performance of the assay, combined with the simplicity and compactness of the platform, and its real-time monitoring capability, make the developed system a promising tool for detecting milk contaminants.

Σε πολλά είδη τροφίμων απαντώνται επιβλαβείς παράγοντες (π.χ. τοξικές ουσίες, μικροοργανισμοί) που καθιστούν τα τρόφιμα επικίνδυνα για τον καταναλωτή. Με στόχο την προστασία των καταναλωτών και τη διασφάλιση της ποιότητας των προϊόντων η Ευρωπαϊκή Ένωση έχει θεσπίσει ανώτερα επιτρεπτά όρια επιμολυντών σε τρόφιμα που είναι επιρρεπή σε επιμολύνσεις, όπως το γάλα. Στο πλαίσιο αυτό, στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η ανάπτυξη οπτικών ανοσοαισθητήρων για ανίχνευση νοθείας γάλακτος, αφλατοξίνης Μ1, καθώς και των βακτηρίων Salmonella typhimurium και Escherichia coli Ο157:Η7 σε δείγματα γάλακτος. Η φωτονική ψηφίδα πυριτίου ενσωματώνει δύο κυματοδηγούς σχήματος U από νιτρίδιο του πυριτίου οι οποίοι έχουν σχηματοποιηθεί σε συμβολόμέτρα Mach-Zehnder (ΜΖΙ). Τα παράθυρα ανίχνευσης και των δύο συμβολομέτρων βρίσκονται στο ένα άκρο της ψηφίδας, επιτρέποντας την εμβάπτιση της ψηφίδας στο δείγμα. Οι ψηφίδες συνδέονται απευθείας με μία πηγή φωτός ευρέως φάσματος και ένα φασματοφωτόμετρο, μέσω μίας δίκλωνης οπτικής ίνας. Το συνδυασμένο φάσμα συμβολής των δύο συμβολομέτρων καταγράφεται συνεχώς κατά τη διάρκεια της ανάλυσης, και εφαρμόζοντας μετασχηματισμό Fourier προσδιορίζονται οι κυματαριθμοί των δύο φασμάτων ως δύο διακριτές κορυφές, επιτρέποντας την παρακολούθηση της απόκρισης του κάθε MZI ξεχωριστά ως μεταβολή φάσης. Στο πλαίσιο της διατριβής αναπτύχθηκαν ανοσοπροσδιορισμοί ανταγωνιστικού τύπου για όλους τους αναλύτες και βελτιστοποιήθηκαν όλες οι παράμετροι των επιμέρους ανοσοπροσδιορισμών. Έτσι, για την ανίχνευση αγελαδινού γάλακτος σε κατσικίσιο, πρόβειο και γάλα γαϊδούρας ακινητοποιήθηκε σε ένα από τα δυο MZI βόεια κ-καζεΐνη (αισθητήρας εργασίας), ενώ για την ανίχνευση της AFM1, ο αισθητήρας εργασίας τροποποιήθηκε με ένα πρωτεϊνικό σύζευγμα της AFM1. Και στις δύο περιπτώσεις στο δεύτερο MZI ακινητοποιήθηκε οραλβουμίνη βοός για την παρακολούθηση πιθανών παρεμβολών από τη μήτρα του δείγματος (αισθητήρας αναφοράς). Στην περίπτωση ταυτόχρονου προσδιορισμού των δύο βακτηρίων, τα δύο ΜΖΙ τροποποιήθηκαν με τους αντίστοιχους λιποπολυσακχαρίτες των δύο βακτηρίων. Οι μέθοδοι που αναπτύχθηκαν χαρακτηρίζονται από υψηλή ευαισθησία, επαναληψιμότητα και ακρίβεια, και σύντομους χρόνους ανάλυσης. Τα εξαιρετικά αναλυτικά χαρακτηριστικά, το μικρό μέγεθος και η απλότητα στη χρήση των αισθητήρων που αναπτύχθηκαν τους καθιστούν ένα ισχυρό εργαλείο για την ανίχνευση επιμολυντών στο γάλα και στα τρόφιμα γενικότερα.