MS/MS-based bone chip species identification

Abstract

Distinctive hominin populations evolved in parallel and sometimes coexisted in the same regions. During the Middle to Upper Palaeolithic transition, the expansion of early Homo sapiens (EHS) and the local replacement of Neanderthals remains one of the most interesting mysteries of human history. Several technocomplexes related to this transition play a critical role in our comprehension of Neanderthal behaviour, cognitive abilities, and demise, as well as the migration of EHS into Europe, and the interplay between Neanderthals and AMHs regarding behaviour and genetics. It is crucial to recover biomolecular data that can be integrated into the archaeological studies to retrieve reliable information about these archaeological sites, such as the eponymous Lincombian-Ranisian-Jerzmanowician (LRJ) site of Ilsenhöhle in Ranis (Germany) and the well-known Neanderthal site of Grotta Guattari (Italy). The development of biomolecular methods allows the identification of the biomolecular markers preserved in previously morphologically unidentified archaeological skeletal remains. The latest innovations in maximizing instrument sensitivity and robustness of mass spectrometry (MS) technologies allow the analysis of highly degraded archaeological specimens. In combination with an extended proteomic database dedicated to taxonomic identification and including extinct taxa provides high-resolution results in recent palaeoproteomic studies. This dissertation utilises these recent advances in mass spectrometry to identify hominin specimens through large-scale high-throughput proteomics screening (MALDI-ToF MS and LC-MS/MS). These methods provide a taxonomic identification based on amino acid sequence variation unique for different taxa. MALDI-ToF MS spectra identifications are based on protein collagen type I variations, while high-throughput proteomic sequencing (LC-MS/MS) identifications are based on species-specific amino acid sequences in 20 different protein genes. This work also combines biomolecular analyses with archaeological evidence to provide new insights into past human behaviour, faunal assemblages, and climatic conditions of Late Pleistocene archaeological cave sites. Moreover, this dissertation delves into the transitional phases associated with either Neanderthals or Homo sapiens and examines the behavioural trends within these hominin populations. The research undertaken facilitated the identification, for the first time, of the biological hominin population linked to the LRJ (Lincombian-Ranisian-Jerzmanowician) in Ranis, Germany. Notably, this marks the first LRJ transitional technocomplex where biomolecular evidence (ancient proteins, ancient DNA) and direct radiocarbon dating on hominin specimens have been made possible. Furthermore, this thesis presents robust data concerning the fauna and human presence at Grotta Guattari, Italy, an archaeological site previously implicated in Neanderthal cannibalism. Our study provides an updated faunal composition of the site, comparing it with the fossil data from other excavation areas of the cave, and discussing its palaeoenvironmental implications. The study also makes some preliminary taphonomic observations. This work revealed four additional hominin skeletal remains.Overall, all the excavation sites presented in the above studies showed different protein preservation. Optimal workflows for archaeological excavations may vary depending on the preservation of bone proteome across various excavation sites. A large-scale comparative study demonstrates that the preferred workflow is directly transferable to other zooarchaeological assemblages. Palaeoproteomics can now benefit different research topics, such as archaeology and palaeoanthropology. This approach enriches our understanding of human evolution, past ecosystems and the movements of ancient populations. Finally, palaeoproteomics can provide insights into environmental changes and hominin adaptation and helps preserve cultural heritage for future generations.

Διακριτοί ανθρώπινοι πληθυσμοί εξελίχθηκαν παράλληλα και, σε ορισμένες περιπτώσεις, συνυπήρξαν στις ίδιες γεωγραφικές περιοχές. Κατά τη μεταβατική φάση από τη Μέση προς την Ανώτερη Παλαιολιθική εποχή, η εξάπλωση των πρώιμων Homo sapiens (EHS) και η τοπική αντικατάσταση των Νεάντερταλ συνιστούν ένα από τα πλέον αινιγματικά ζητήματα της ανθρώπινης ιστορίας. Διάφορα τεχνοσύμπλοκα που συνδέονται με αυτή τη μετάβαση διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στην κατανόηση της συμπεριφοράς των Νεάντερταλ, των γνωστικών τους ικανοτήτων και της εξαφάνισής τους, καθώς και στη διερεύνηση της μετανάστευσης των πρώιμων Homo sapiens στην Ευρώπη και των πολύπλοκων αλληλεπιδράσεων μεταξύ Νεάντερταλ και ανατομικά συγχρόνων ανθρώπων (AMH), τόσο σε συμπεριφορικό όσο και σε γενετικό επίπεδο. Η ανάκτηση βιομοριακών δεδομένων, τα οποία δύνανται να ενσωματωθούν στις αρχαιολογικές μελέτες, είναι καθοριστικής σημασίας για την εξαγωγή αξιόπιστων πληροφοριών αναφορικά με αρχαιολογικούς χώρους, όπως το επώνυμο σύνολο Lincombian-Ranisian-Jerzmanowician (LRJ) στο Ilsenhöhle του Ranis (Γερμανία) και ο γνωστός νεαντερτάλειος χώρος της Grotta Guattari (Ιταλία). Η ανάπτυξη και εφαρμογή βιομοριακών μεθόδων καθιστά εφικτή την ανίχνευση και αναγνώριση βιομοριακών δεικτών, οι οποίοι έχουν διατηρηθεί σε σκελετικά κατάλοιπα που έως πρόσφατα δεν ήταν δυνατόν να ταυτοποιηθούν μορφολογικά.Οι πρόσφατες τεχνολογικές καινοτομίες στη μεγιστοποίηση της ευαισθησίας και της ανθεκτικότητας των τεχνολογιών φασματομετρίας μάζας (MS) επιτρέπουν πλέον την ανάλυση εξαιρετικά αποδομημένων αρχαιολογικών δειγμάτων. Σε συνδυασμό με εκτεταμένες πρωτεωμικές βάσεις δεδομένων, οι οποίες είναι ειδικά σχεδιασμένες για ταξινομική ταυτοποίηση και περιλαμβάνουν και εξαφανισμένα είδη, κατέστη δυνατή η επίτευξη υψηλής ανάλυσης αποτελεσμάτων σε πρόσφατες παλαιοπρωτεωμικές μελέτες. Η παρούσα διατριβή αξιοποιεί αυτές τις τεχνολογικές εξελίξεις στη φασματομετρία μάζας με σκοπό την ταυτοποίηση ανθρώπινων δειγμάτων μέσω μεγάλης κλίμακας και υψηλής απόδοσης πρωτεωμικού ελέγχου (MALDI-ToF MS και LC-MS/MS). Οι μέθοδοι αυτές παρέχουν τη δυνατότητα ταξινομικής ταυτοποίησης βάσει παραλλαγών στις αλληλουχίες αμινοξέων που είναι χαρακτηριστικές για διαφορετικά είδη. Οι ταυτοποιήσεις μέσω φασμάτων MALDI-ToF MS στηρίζονται σε παραλλαγές του κολλαγόνου τύπου Ι, ενώ οι ταυτοποιήσεις μέσω υψηλής απόδοσης πρωτεωμικής αλληλούχησης (LC-MS/MS) βασίζονται σε ειδικές αλληλουχίες αμινοξέων σε 20 διαφορετικά γονίδια πρωτεϊνών. Επιπλέον, το παρόν έργο συνδυάζει βιομοριακές αναλύσεις με αρχαιολογικά δεδομένα, προκειμένου να προσφέρει νέα ερμηνευτικά σχήματα σχετικά με την ανθρώπινη συμπεριφορά στο παρελθόν, την πανίδα και τις κλιματικές συνθήκες των αρχαιολογικών σπηλαίων του Ύστερου Πλειστόκαινου. Η διατριβή εξετάζει περαιτέρω τις μεταβατικές φάσεις που συνδέονται με τους Νεάντερταλ ή τους Homo sapiens, διερευνώντας τις συμπεριφορικές τάσεις εντός αυτών των πληθυσμών. Η διεξαχθείσα έρευνα κατέστησε εφικτή, για πρώτη φορά, την ταυτοποίηση του βιολογικού ανθρώπινου πληθυσμού που σχετίζεται με το LRJ (Lincombian-Ranisian-Jerzmanowician) στο Ranis της Γερμανίας. Ιδιαιτέρως αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι πρόκειται για το πρώτο μεταβατικό τεχνοσύμπλοκο LRJ στο οποίο κατέστη δυνατή η ταυτοποίηση βιομοριακών δεδομένων (αρχαίες πρωτεΐνες, αρχαίο DNA) σε συνδυασμό με άμεση ραδιοχρονολόγηση ανθρώπινων δειγμάτων. Περαιτέρω, η διατριβή παρουσιάζει νέα, τεκμηριωμένα δεδομένα σχετικά με την πανίδα και την ανθρώπινη παρουσία στη Grotta Guattari (Ιταλία), έναν αρχαιολογικό χώρο που είχε στο παρελθόν συνδεθεί με τον κανιβαλισμό των Νεάντερταλ. Η μελέτη παρέχει μια επικαιροποιημένη σύνθεση της πανίδας του χώρου, συγκρίνοντάς την με παλαιότερα δεδομένα προερχόμενα από άλλες ανασκαφικές περιοχές του σπηλαίου και συζητώντας τις παλαιοπεριβαλλοντικές τους προεκτάσεις. Παράλληλα, καταγράφονται ορισμένες προκαταρκτικές ταφονομικές παρατηρήσεις. Η έρευνα αποκάλυψε τέσσερα επιπλέον ανιρώπινα σκελετικά φραύσματα οστών, πιθανόν Νεάντερταλ. Συνολικά, οι αρχαιολογικοί χώροι που εξετάζονται στην παρούσα μελέτη ανέδειξαν διαφοροποιήσεις ως προς τη διατήρηση των πρωτεϊνών. Η επιλογή των βέλτιστων πρωτοκόλλων για αρχαιολογικές ανασκαφές ενδέχεται να διαφοροποιείται αναλόγως του βαθμού διατήρησης του οστικού πρωτεώματος σε διαφορετικά πεδία έρευνας. Μια συγκριτική μελέτη καταδεικνύει ότι τα προτιμώμενα πρωτόκολλα μπορούν να εφαρμοστούν μεταβιβάσιμα και σε άλλες μελέτες. Η παλαιοπρωτεωμική, ως αναδυόμενος επιστημονικός κλάδος, δύναται πλέον να προσφέρει ουσιαστική συμβολή σε πολλαπλά ερευνητικά πεδία, όπως η αρχαιολογία και η παλαιοανθρωπολογία. Η προσέγγιση αυτή εμπλουτίζει τη γνώση μας για την ανθρώπινη εξέλιξη, τα προϊστορικά οικοσυστήματα και τις μετακινήσεις των αρχαίων πληθυσμών. Τέλος, η παλαιοπρωτεωμική παρέχει κρίσιμες πληροφορίες για τις περιβαλλοντικές μεταβολές και την προσαρμοστικότητα των ανθρώπινων πληθυσμών, ενώ ταυτόχρονα συμβάλλει στη διαφύλαξη της πολιτιστικής κληρονομιάς για τις επόμενες γενιές.

Verscheidene menselijke populaties zijn parallel aan elkaar geëvolueerd en leefden soms naast elkaar in dezelfde regio’s gedurende dezelfde periode. De verspreiding van vroege Homo sapiens (EHS) en hun vervanging van lokale Neanderthalerpopulaties tijdens de overgang van het Midden- naar Laat-Palaeolithicum blijft een van de meest interessante mysteries van de menselijke geschiedenis. De verschillende technocomplexen geassocïeerd met deze overgangsperiode spelen een cruciale rol in ons begrip van het gedrag, de cognitieve vermogens en het verdwijnen van Neanderthalers, evenals de migratie van vroege Homo sapiens (EHS) naar Europa, en de wisselwerking tussen Neanderthalers en AMHs met betrekking tot gedrag en genetica. Het is cruciaal om biomoleculaire data te verzamelen die geïntegreerd kan worden in archeologisch onderzoek om betrouwbare informatie te verkrijgen over deze archeologische vindplaatsen, zoals de gelijknamige Lincombian-Ranisian-Jerzmanowician (LRJ) vindplaats van Ilsenhöhle in Ranis (Duitsland) en de bekende Neanderthaler vindplaats van Grotta Guattari (Italië). De ontwikkeling van biomoleculaire methoden maakt de identificatie van biomoleculaire markers mogelijk die bewaard zijn gebleven in eerder morfologisch ongeïdentificeerde archeologische skeletresten. De nieuwste innovaties in het maximaliseren van de gevoeligheid en robuustheid van massaspectrometrie (MS)-technologieën maken het mogelijk om sterk gedegradeerde archeologische objecten te analyseren. In combinatie met een uitgebreide eiwitdatabase, opgezet voor taxonomische identificatie, en inclusief uitgestorven taxa, hebben deze technologieën hoogwaardige resultaten geleverd in recente palaeoproteomische studies. In dit proefschrift wordt gebruik gemaakt van de recentste ontwikkelingen in massaspectrometrie om menselijke resten te identificeren via grootschalige, high-throughput proteomic screening (MALDI-ToF MS en LC-MS/MS). Deze methoden leveren een taxonomische identificatie op basis van de variatie in aminozuursequenties, die verschilt tussen taxa. Identificaties van MALDI-ToF MS-spectra zijn gebaseerd op variaties in type I-collageen, terwijl identificaties van high-throughput proteomic analyse (LC-MS/MS) zijn gebaseerd op soortspecifieke aminozuursequenties in 20 verschillende eiwitten. Daarnaast combineert dit werk de biomoleculaire analyses ook met archeologische vondsten om nieuwe inzichten te bieden in het menselijk gedrag uit het verleden, het dierlijk botmateriaal en klimatologische omstandigheden van Laat Pleistocene archeologische vindplaatsen. Specifiek duikt dit proefschrift in de overgangsfases die geassocieerd worden met zowel Neanderthalers als Homo sapiens, en onderzoekt het de gedragstrends binnen deze menselijke populaties. Het uitgevoerde onderzoek heeft voor het eerst de biologische identificatie mogelijk gemaakt van de menselijke populatie die verbonden is met de LRJ in Ranis, Duitsland. Opmerkelijk is dat dit de eerste vindplaats van het LRJ is, waarvan biomoleculair bewijs (oude eiwitten, oud DNA) en directe radiokoolstofdatering op menselijk materiaal beschikbaar is. Verder presenteert deze scriptie robuuste gegevens met betrekking tot de aanwezigheid van mensen en dieren in Grotta Guattari, Italië, een archeologische vindplaats die eerder in verband werd gebracht met kannibalisme onder Neanderthaler. Het gepresenteerde onderzoek biedt een bijgewerkte fauna-compositie van de grot, waarbij dit vergeleken wordt met de dierlijke resten uit andere opgravingsputten binnen de grot, en bespreekt de implicaties daarvan op paleoklimaat reconstructie. Verder maakt dit onderzoek enkele voorlopige tafonomische observaties. Daarnaast heeft dit werk vier extra menselijke skeletresten aan het licht gebracht Over het algemeen toonden alle vindplaatsen die in de bovengenoemde studies werden gepresenteerd verschillende mate van eiwitpreservatie. De optimale analysestrategie voor een archeologische opgraving kan daarom variëren, afhankelijk van de preservatie van de boteiwitten op een vindplaats. Een grootschalig vergelijkend onderzoek laat zien dat de meest geschikte workflow direct toepasbaar is op andere zooarcheologische assemblages. Palaeoproteomics kan nu verschillende onderzoeksgebieden ten goede komen, zoals archeologie en palaeoantropologie. Deze benadering verrijkt ons begrip van de menselijke evolutie, vroegere ecosystemen en de verspreiding van menselijke populaties in het verleden. Tenslotte kan palaeoproteomics inzicht bieden in milieuveranderingen en de aanpassingen van vroegere mensachtigen daaraan, en helpt het cultureel erfgoed voor toekomstige generaties te behouden.