Πτητικό προφίλ και χημειοτυπική ποικιλομορφία των αιθέριων ελαίων αρωματικών και φαρμακευτικών φυτών των οικογενειών Asteraceae και Lamiaceae: αξιολόγηση της βιοδραστικότητας και της τοξικότητας των εκχυλισμάτων και εγχυμάτων τους μέσω βιοδοκιμών

Abstract

In the context of this thesis, the chemical composition, bioactivity, and toxicity of selected medicinal and aromatic plants of the Greek flora belonging to the families Asteraceae and Lamiaceae were studied. The aim of the study was to determine the volatile profile of the essential oils and infusions of botanical species Artemisia absinthium, Artemisia dracunculus, Achillea millefoilum, Matricaria chamomilla, Lavandula angustifolia, Salvia officinalis, Salvia fruticosa, Salvia pomifera and Salvia sclarea, as well as to evaluate the total phenolic content and antioxidant activity of their aqueous extracts. Moreover, the toxicity of the aqueous extracts was assessed against the bacterium Vibrio fischeri, as well as their hepatotoxicity, nephrotoxicity and neurotoxicity. The first experimental part of the study focused on the qualitative and quantitative (%) analysis of the volatile compounds of the essential oils and infusions of the botanical species, as well as the quantitative determination of specific volatile compounds — borneol, camphor, 1,8-cineole, linalool, estragole, α-and β-thujone —using gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The analyses revealed that chemical diversity among the species, while the volatile profile also appeared to vary within a single species depending on its geographical origin. Furthermore, the extraction temperature was found to significantly the volatile profile of infusions. The quantitative determination of the potential toxic components showed that, in some essential oils, the concentration of camphor, estragole, α- and β-thujone, exceeded the permissible consumption limits.In the second part of the study, the total phenolic content (TPC) and the antioxidant capacity of infusions and aqueous extracts were evaluated using Folin-Ciocalteu and DPPH assay, respectively. The infusions of Salvia species and L. angustifolia exhibited the highest levels of TPC and antioxidant activity, while intra-species and inter-species variation was observed in infusion depending on their geographical origin. Furthermore, the extraction temperature significantly affected both TPC and antioxidant capacity. The interaction was found to be either synergistic or antagonistic between volatile and water-soluble compounds in the infusion, according to TPC and antioxidant activity. Notably, the aqueous residues from hydro-distillation also showed considerable total phenolic content and antioxidant potential, representing an important source of bioactive compounds. Moreover, the use of α- and β-cyclodextrins proved to be particularly effective in incapsulating potentially toxic volatile compounds of S. officinalis infusion, while simultaneously preserving its antioxidant potential and total phenolic content. Thus, cyclodextrins appear to be a useful tool for improving the quality and safety of herbal infusion. The third part of the study focused on assessment of the toxicity of aqueous extracts using in vitro assays. Firstly, the evaluation of toxicity against Vibrio fischeri by Microtox assay showed significant variations depending on botanical species, geographical origin and extraction temperature. The average toxicity values indicated that the infusions of M. chamomilla and Art. dracunculus were the most toxic. By increasing the extraction temperature, the toxicity appeared to enhance the toxicity. In most cases, the inhibition of bioluminescence of Vibrio fischeri resulted from synergistic interaction between volatile and water-soluble compounds. Moreover, the aqueous residues also exhibited considerable activity against Vibrio fischeri, which varied according to species and origin. The infusions exhibited different levels of cytotoxicity, with the infusion of Achillea millefolium showing the highest cytotoxicity effect, significantly reducing hepatocyte viability. In all cases, hepatotoxicity of infusion appeared to be dose-dependent. Furthermore, in most cases, the hepatotoxicity was attributed to the synergy between water-soluble and volatile compounds, whereas in two cases — S. officinalis and L. angustifolia— the coexistence of these two groups of compounds acted antagonistically. The effect of the herbal infusions on the viability and morphology of the Vero kidney cell line was evaluated using the MTT assay and microscopic observations. The nephrotoxicity of the infusions varied significantly among the species, with their effect on cell viability ranging from negligible to cell death. The infusions of Ach. millefolium, Art. dracunculus, S. officinalis and S. fruticosa exhibited the highest nephrotoxicity. The neurotoxicity of the infusions on human neuroblastoma SHSY-5Y cells also varied depending on the species and the dose. All the infusions showed dose-dependent reduction in cell viability, either gradual or pronounced. The most neurotoxic infusion was that of Salvia pomifera.

Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής μελετήθηκε η χημική σύσταση, η βιοδραστικότητα και η τοξικότητα επιλεγμένων αρωματικών και φαρμακευτικών φυτών της ελληνική χλωρίδας των οικογενειών Asteraceae και Lamiaceae. Στόχος της μελέτης ήταν ο προσδιορισμός του πτητικού προφίλ των αιθερίων ελαίων και των εγχυμάτων των βοτανικών ειδών Artemisia absinthium, A. dracunculus, Achillea millefolium, Matricaria chamomilla, Lavandula angustifolia, Salvia officinalis, S. fruticosa, S. pomifera και S. sclarea, καθώς και η αξιολόγηση του ολικού φαινολικού περιεχομένου και της αντιοξειδωτικής ικανότητας των υδατικών εκχυλισμάτων τους. Επιπλέον, έγινε η εκτίμηση της τοξικότητας έναντι του βακτηρίου Vibrio fischeri, της ηπατοτοξικότητας, της νεφροτοξικότητας και νευροτοξικότητας των υδατικών εκχυλισμάτων των βοτανικών ειδών. Το πρώτο πειραματικό μέρος της μελέτης επικεντρώθηκε στην ποιοτική και ποσοτική (%) ανάλυση των πτητικών συστατικών των αιθερίων ελαίων και των εγχυμάτων των βοτανικών ειδών, και στον ποσοτικό προσδιορισμό των επιμέρους πτητικών συστατικών βορνεόλη, καμφορά, 1,8-κινεόλη, λιναλοόλη εστραγόλη, α- και β-θουγιόνη, με την χρήση της αέρια χρωματογραφίας-φασματομετρίας μαζών (GC-MS). Η ανάλυση έδειξε χημική ποικιλομορφία μεταξύ των ειδών, ενώ το πτητικό προφίλ του κάθε είδους εμφάνισε ενδοειδική διαφοροποίηση με βάση την γεωγραφική προέλευση. Επιπλέον, η θερμοκρασία εκχύλισης φάνηκε να επηρεάζει σημαντικά το πτητικό προφίλ των εγχυμάτων. Μέσω του ποσοτικού προσδιορισμού των δυνητικά τοξικών συστατικών, διαπιστώθηκε ότι σε ορισμένα αιθέρια έλαια οι συγκεντρώσεις της α- και β-θουγιόνης, της καμφοράς και της εστραγόλης υπερέβαιναν τα επιτρεπτά όρια κατανάλωσης. Στο δεύτερο μέρος της μελέτης αξιολογήθηκε το συνολικό φαινολικό περιεχόμενο (ΟΦΠ) και η αντιοξειδωτική ικανότητα των εγχυμάτων και των εκχυλισμάτων τους με τις δοκιμές Folin-Ciocalteu και DPPH, αντίστοιχα. Τα εγχύματα των ειδών του γένους Salvia και του L. angustifolia παρουσίασαν τα υψηλότερα επίπεδα ΟΦΠ και αντιοξειδωτικής ικανότητας, ενώ σε όλα τα εγχύματα παρατηρήθηκε ενδοειδική και διαειδική διαφοροποίηση με βάση την γεωγραφική προέλευση. Επιπλέον, η θερμοκρασία εκχύλισης επηρέασε σημαντικά τόσο το ΟΦΠ όσο και την αντιοξειδωτική ικανότητα. Η αλληλεπίδραση των πτητικών και των υδατοδιαλυτών συστατικών στα εγχύματα ως προς το ΟΦΠ και ως προς την αντιοξειδωτική ικανότητα βρέθηκε να είναι είτε συνεργιστική είτε ανταγωνιστική. Σημαντική ήταν και η αξιολόγηση των υδατικών υπολειμμάτων της υδροαπόσταξης, τα οποία είχαν υψηλό περιεχόμενο σε φαινολικές ενώσεις και αντιοξειδωτικό δυναμικό, αποτελώντας έτσι σημαντικές πηγές βιοδραστικών ενώσεων. Επιπλέον, η χρήση των α- και β-κυκλοδεξτρινών αποδείχτηκε ιδιαίτερα αποτελεσματική στον εγκλεισμό ορισμένων, δυνητικά τοξικών, πτητικών συστατικών του εγχύματος του S. officinalis και ταυτόχρονα διατήρησε το αντιοξειδωτικό δυναμικό και την περιεκτικότητα σε φαινολικές ενώσεις. Οι κυκλοδεξτρίνες επομένως αναδεικνύονται ως ένα σημαντικό μέσο για την βελτίωση της ποιότητας και την ασφαλή κατανάλωση του εγχύματος.Το τρίτο μέρος της μελέτης αφορούσε την εκτίμηση της τοξικότητας των υδατικών εκχυλισμάτων με in vitro δοκιμές. Η τοξικότητα έναντι του Vibrio fischeri που πραγματοποιήθηκε με την δοκιμή Microtox, παρουσίασε σημαντικές διαφοροποιήσεις ανάλογα το βοτανικό είδος, τη γεωγραφική προέλευση και την θερμοκρασία εκχύλισης των εγχυμάτων. Οι μέσες τιμές τοξικότητας ανέδειξαν τα εγχύματα των ειδών M. chamomilla και Art. dracunculus ως τα πιο τοξικά. Η αύξηση της θερμοκρασίας εκχύλισης φάνηκε να επιδρά ενισχυτικά στην τοξικότητα των εγχυμάτων. Στην πλειοψηφία των εγχυμάτων η αναστολής της βιοφωταύγειας του Vibrio fischeri προέκυψε από συνεργιστική δράση μεταξύ των πτητικών και των υδατοδιαλυτών συστατικών. Τα υδατικά υπολείμματα παρουσίασαν επίσης σημαντική δράση έναντι του Vibrio fischeri, η οποία διαφοροποιήθηκε ανά είδος και περιοχή. Παράλληλά, τα εγχύματα εμφάνισαν διαφορετικά επίπεδα ηπατοτοξικότητας, με το έγχυμα του Ach. millefolium να έχει την υψηλότερη κυτταροτοξική δράση, μειώνοντας σημαντικά την βιωσιμότητα των ηπατοκυττάρων. Σε όλες τις περιπτώσεις εγχυμάτων η ηπατοτοξικότητα φάνηκε να είναι δοσοεξαρτώμενη. Τέλος, για τα περισσότερα βοτανικά είδη η ηπατοτοξικότητα αποδόθηκε στην συνέργεια των υδατοδιαλυτών και πτητικών συστατικών, ενώ σε δυο περιπτώσεις εγχυμάτων, S. officinalis και L. angustifolia η συνύπαρξη των δυο ομάδων λειτούργησε ανταγωνιστικά. Η επίδραση των βοτανικών εγχυμάτων στη βιωσιμότητα και τη μορφολογία της νεφρικής κυτταρικής σειράς Vero αξιολογήθηκε μέσω της δοκιμής MTT και παρατηρήσεων σε μικροσκόπιο. H νεφροτοξικότητα των εγχυμάτων διέφερε σημαντικά μεταξύ των ειδών, η επίδραση στην βιωσιμότητα των κυττάρων κυμάνθηκε από μηδενική μέχρι και τον κυτταρικό θάνατο. Τα εγχύματα των ειδών Ach. millefoilium, Αrt. dracunculus, S. officinalis, και S. fruticosa είχαν την υψηλότερη νεφροτοξικότητα. Η νευροτοξικότητα των εγχυμάτων στα κύτταρα ανθρώπινου νευροβλαστώματος SHSY-5Y, διέφερε ανάλογα με το είδος και την δόση. Σε όλα τα εγχύματα παρατηρήθηκε δοσοεξαρτώμενη μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας άλλοτε σταδιακά και άλλοτε πιο έντονη. Το έγχυμα του είδους S. pomifera ήταν το πιο νευροτοξικό.